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iugogo

铜虫 (小有名气)

[求助] RNA干涉

请教一下大家,我最近做RNA干涉,dsRNA的浓度分别用了50,100,150ng/ul,ddH2O溶解,以ddH2O处理和未做任何处理的样品为对照。处理3天后做荧光定量发现,3种浓度的处理都比对照上调了好多倍,不知道是什么原因,请教一下!(模板测序过,是正确的)
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heath666

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1,确定RNAi是否有效。因为不是所有设计的dsRNA都会有效果,而且你只选择一个72h时间点是不够的,建议多设计几对dsRNA,并且多加几个时间点。
2,原则上RNA水平也不能完全代替蛋白水平,可以再用WB等检测下蛋白水平。
3,即使以上条件都满足,有的时候也确实存在这个问题,原因还不确定,可能与脱靶效应或者不同基因的相互作用有关。

希望能有帮助!
2楼2012-04-30 13:02:29
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iugogo

铜虫 (小有名气)

送鲜花一朵
非常感谢heath666的解答!在plos one 有一篇文章中,RNAi后不同时间段表达量是先上调然后再下调。我那个实验从表型上看,RNAi应该是起到作用了,我再检测几个时间段,再设计几个dsRNA看看。非常感谢您的建议!
3楼2012-04-30 22:51:03
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nemo88

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

4楼2012-04-30 23:00:33
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
碰到上调的时候,确认一下,你做RT的引物和你的dsrna的片段两端是不一样;
要是一样的话,有时候会是dsrna里残留的dnd,如果rt引物设计在ds的外围,那就另当别论。
活着就要让人感受到你的存在。
5楼2012-05-01 15:11:30
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dongyingqian

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

有个问题请教楼主,做对照用的dd水,有PH要求吗。还有注射量是多少啊,我最近也想做呢
6楼2013-05-29 11:29:22
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iugogo

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by dongyingqian at 2013-05-29 11:29:22
有个问题请教楼主,做对照用的dd水,有PH要求吗。还有注射量是多少啊,我最近也想做呢

我是用的DEPC处理水,没调PH值,用试剂盒里的buffer也行。根据注射对象的大小吧,要试一下,我注射的是虫子,有一个绿豆那么大,0.5微升左右,也死了一些,多了会死更多
7楼2013-05-29 17:40:03
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