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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 表达载体构建碰到诡异问题，请各路大神不吝赐教，拜谢。
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ytulz111

新虫 (小有名气)

[求助] 表达载体构建碰到诡异问题，请各路大神不吝赐教，拜谢。

事情是这样，我要构建一个表达载体，目的片段大约2000bp，后面要加GFP作为marker。筛出阳性克隆来之后，提质粒测序验证。这时诡异问题出现了，因为我这个基因比较大，需要用多个测序引物，比如A,B两个引物。A为正向，B为反向，两者有overlapping。从A的结果看，有一段是我的目的基因，而接下来的却是载体的序列（比如A的测序结果是500bp，前200bp是我的目的基因的序列，201-500却是载体的序列）。但是从B的结果看这500bp却都是我的目的基因的序列。不知道这是什么原因啊。

PS.测序结果都很好，没有杂峰和套峰。
如果问题解决，本人愿赠送100金币作为酬谢。谢谢各位了。
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1楼 2012-04-21 16:37:56
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ynkuaile

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励帮助解答，欢迎继续交流。 2012-04-21 20:35:05
传一下断裂处的峰图看看。要不你再测一次，看看结果。让测序公司给测序结果的时候顺便拼接下，然后再自己仔细看看。
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2楼2012-04-21 20:00:46
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
你的a和b不是载体上的通用引物么？
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3楼2012-04-21 21:56:13
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ytulz111

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ynkuaile at 2012-04-21 20:00:46:
传一下断裂处的峰图看看。要不你再测一次，看看结果。让测序公司给测序结果的时候顺便拼接下，然后再自己仔细看看。

附近是断裂处的峰图。我们自己实验室测序的，不送公司。
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4楼2012-04-22 12:08:45
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ytulz111

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by XOooZzz at 2012-04-21 21:56:13:
你的a和b不是载体上的通用引物么？

不是，是自己设计的特异引物。
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5楼2012-04-22 12:09:25
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sunwei57

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
基因在连接的过程中断裂了,大片段连接会遇到这种情况的,重新做吧
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6楼2012-04-22 21:57:38
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AnaSequence

金虫 (小有名气)
我也碰到过目的片段中间部分有丢失.
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7楼2012-04-24 08:42:24
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