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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 兼并引物 里边有多个兼并碱基好吗？
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XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by char0523 at 2012-04-17 15:42:20:
一条兼并引物里不要超过2个碱基，不然扩增起来比较麻烦，不特异，3’端后十个碱基最好不要兼并。楼主设计的引物勉强可用！


PS：应助是啥？？？

恩，那就试一下吧， 希望能扩出目的片段来，谢谢
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心，是用来使用的，不能搁浅！
11楼2012-04-17 19:20:12
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XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by char0523 at 2012-04-17 15:42:20:
一条兼并引物里不要超过2个碱基，不然扩增起来比较麻烦，不特异，3’端后十个碱基最好不要兼并。楼主设计的引物勉强可用！


PS：应助是啥？？？

怎么说我是铜虫，没法给你分啊，不好意了！
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心，是用来使用的，不能搁浅！
12楼2012-04-17 19:22:14
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XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by love_st at 2012-04-17 10:11:07:
大哥，没看到你上面有简并的地方啊

红色的k r b这些不是兼并碱基吗？
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心，是用来使用的，不能搁浅！
13楼2012-04-17 19:26:07
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XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-04-17 18:16:14:
上游引物看起来挺好，但下游引物不太好，其一两个兼并碱基连着应该不太好吧，可在密码子偏好性网站上查一下该物种的偏好密码子（http://www.kazusa.or.jp/codon/），或者你把下游引物设成几条以降低碱并度，另外引 ...

恩，是啊，3端最好不要有A，不过我不明白，为什么不能有A，你能给我说说嘛，谢谢
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心，是用来使用的，不能搁浅！
14楼2012-04-17 19:29:13
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zhang7311
祝福
15楼2012-04-17 19:45:26
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XI4ZHL

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by zhang7311 at 2012-04-17 19:45:26:
祝福

谢谢
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心，是用来使用的，不能搁浅！
16楼2012-04-17 21:29:35
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AnaSequence

金虫 (小有名气)
我通常会BLAST找很多序列来寻找保守区,因而,很难找到简并度低的引物.不过,适当的位置会只参考最接近目的物种的序列来选择猜测碱基.由于简并性,什么二级结构,引物二聚体等,都不考虑那么严格,更不用说3`末端用A这样的细节.由于其中一条引物确切性比较高,另一条简并度高的引物即使错误扩增,也没有别人用随机引物那么厉害,至少得到相似大小的非目的片段的机会少很多.引物偏短少许,可以在5`端加猜测性非简并碱基.后面的关键在于退火温度的摸索了.
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17楼2012-04-18 00:20:24
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by XI4ZHL at 2012-04-17 19:29:13:
恩，是啊，3端最好不要有A，不过我不明白，为什么不能有A，你能给我说说嘛，谢谢

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
但这种情况也不是绝对的，如果引物设计的好的话，3端有A也没有问题的
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18楼2012-04-18 09:19:20
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gjs713

至尊木虫 (职业作家)
你的下游引物兼并得太多了吧

我们这边设计这个的原则是不超过3个，并且不连续出现
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勤奋、执着、专注，则无坚不破。
19楼2012-04-18 10:43:31
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
我觉得引物短了点，而且还有兼并引物，可能会多少影响扩增的专一性，另外，我个人认为下游引物3‘末端应以G/C结尾可能扩增的专一性会略有上升（可能GC或CG较好），因为引物较短，可能这样作用还稍大些。

我现在的课题侧重结构生物学和系统生物学，分子生物学的东东有时间没有做了，只是无聊吐槽，楼主和看官们表生气。
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20楼2012-04-20 00:52:44
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