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vividfly

铜虫 (小有名气)

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专业: 水产生物免疫学与病害控制

[求助] 小鼠肝脏石蜡切片问题切片已有1人参与

小鼠脏脏石蜡切片处理过程：
取材0.5立方毫米小块，carnoy固定4摄氏度4小时，30%-50%-70%80%-95%-无水乙醇各级乙醇脱水50分钟，其中95乙醇和无水乙醇分两级，每级25分钟，无水乙醇二甲苯等量混合处理30分钟，纯二甲苯两级，每级20分钟，二甲苯和石蜡等量混合处理15分钟，纯石蜡两级每级20分钟。
请教各位高手，为什么经过上述处理的小鼠肝脏石蜡切片组织结构不清楚，看不到细胞轮廓，是处理过程中哪一步出了问题？不胜感激……

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1楼2012-04-09 17:07:20

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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain

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红花: 22
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注册: 2007-04-14
专业: 临床生物化学检验

我这个做的不多。我做的是小鼠骨头的，做的很抑郁。做的免疫荧光，种种原因，但主要问题是结构不完整。

看你说的，你这个是蜡块的制作问题，前面蜡块这部分我没做过，我都是找人切好了的，虽然切得。。。。。。。。。

找到个流程你参考下：
蜡块制备：乙醇脱水过程，脱水的目的
组织内的水不能和支持剂混合，所以必须把组织中的水分彻底脱除。脱水有利于组织的透明和浸蜡，有利于组织的永久保存。
50%乙醇 6~8小时
75%乙醇 6~8小时
85%乙醇 3~5小时
95%乙醇 1~2小时
95%乙醇 1~2小时
100%乙醇Ⅰ 1小时
100%乙醇Ⅱ 1小时
注意事项：
（1）脱水的过程应逐步地而不应骤然地进行，不能操之过急。
（2）脱水的时间应根据组织块的大小和组织的类型而定。
（3）组织块在高浓度，特别是无水乙醇内不能放置的时间太长。无水乙醇吸水能力太强，容易造成组织块的过度硬化，使得切片理组织易碎裂。
（4）在脱水的过程中可以将组织块停留在70%~80%的酒精中。
（5）每次更换新的脱水剂时（组织块从低浓度到高浓度），都要把组织块放在吸水纸上吸干，装组织块的容器也要控干水分，以免将水及低浓度脱水剂带入高浓度脱水剂中，影响脱水效果。
（6）脱水剂的先择要根据实验的要求及实验室的条件
两次透明二甲苯：透明的目的
置换组织内的脱水剂，为下一步的浸蜡起到桥梁作用；使组织呈现不同程度的透明状态，有利于光线的透过。
第一次透明约40分钟
第二次时间不一定，要视透明效果而定
注意事项
（1）时间不宜过长，否则组织会变脆；
（2）组织块脱水必彻底。
浸蜡的步骤，浸蜡的目的置换组织中的透明剂，为包埋做准备。
取透明好的组织块放入软蜡中各1小时，迅速取出放入硬蜡，同样放置1小时。
注意事项
温箱中的温度必须严格控制在60℃的范围，不能超过60℃；浸蜡时间不宜过长。浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度收缩和脆变。
包埋后的蜡块应呈均质半透明状，如果出现白色混浊状，一般出现在组织周围或组织的底部，应考虑这样几个方面的问题：a. 脱水不彻底。b.包埋蜡温度低了，组织进行包埋时，包埋框中的蜡已成凝结状。c.组织内还残留有较多的透明剂，d.石蜡不纯。

[ Last edited by telomerase on 2012-4-11 at 11:33 ]