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yangzhengnan

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光pcr标准曲线问题

今天做了一条标准曲线,很奇怪,目的基因模板按2倍稀释,但是ct值却相差很小,复孔之间的差别很大,但内参复孔间的差别很小,不知各位大侠可不可以给点建议呢?到底是哪里出了问题?
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小慈abc

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by beautybanana at 2014-06-26 21:16:23
浓度不能太高, 否则扩增的曲线会有些异常, PCR体系中最高的浓度你可以用0.5 ng/ul, 后面0.05ng/ul, 10倍稀释的...你先试试, 有问题再继续问我好了....

还有一个关于您说的稀释液的问题  我试过用水稀释和稀释液稀释两个相同浓度梯度的ct值差很多 稀释液的ct值要大一些 这是为什么呢?
16楼2014-06-27 08:40:16
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查看全部 22 个回答

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★
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西瓜: 金币+2, 2倍确实太小 2012-04-05 18:43:54
有图有真相
复孔指的技术重复吗?如果是的,注意加样误差,甩出来一丁点都会影响Ct值,同样注意机子可能有加热不匀的情况
为何做2倍稀释呢,太小了吧,稀释10倍看看吧
个人经验,若有说错,高手指点哦
Let God do with it as He wills
2楼2012-04-05 17:38:21
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
跟我遇到的问题一样,多做几次吧。有可能是基因丰度太低,所以你稀释的不均匀可能是主要原因。因为内参的丰度高,所以你操作的影响不大,但是目的基因就不一样了
3楼2012-04-05 18:35:57
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
理想情况下扩增效率为100%,产物按2的N次方递增,如果模板量相差8倍,Ct值也就相差3而已(2^3=8),所以你的2倍梯度,Ct值也就相差1左右。一般做标准曲线取10倍梯度比较常见哦。
4楼2012-04-05 18:45:51
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