[交流] PCR提取试剂盒不见了，手动配置DNA提取试剂一般都需要准备哪些试剂？已有8人参与

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joyfuldog

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1楼2012-03-30 20:32:52

telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain

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danyzj01: 回帖置顶 2012-04-15 21:26:06

以前做的了：我提的细胞的
手提基因组：
用胰蛋白酶消化HEL细胞，收集约106－108个细胞，500×g离心5min，弃上清。再加入PBS重悬细胞，500×g离心5min，弃上清，将多余的PBS吸净。加入400μl裂解液（10mmol/L Tris pH 8.0，0.1mol/L EDTA，0.5% SDS），轻轻吹打，充分混匀，使细胞完全裂解。加入蛋白酶K至终浓度为100μg/ml，轻轻吹打，充分混匀，于50℃水浴中孵育3h。加入等体积的Tris饱和酚吹打混匀，12000×g离心10min，将上清移入一个新的EP管中。再加入等体积氯仿∶异戊醇（24∶1）吹打混匀，12000×g离心10min，将上清移入一个新的EP管中。加入等体积异丙醇，于－20℃沉淀过夜。12000×g离心10min，弃上清。用75％乙醇洗沉淀一次，12000×g离心10min，弃上清，室温干燥。加入50μl含RNase（浓度为20μg/ml）的TE（10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA pH8.0）溶解DNA沉淀，可于37℃助溶。

手提质粒的那个配方没找到，只记得1，2,3,4号液了，用的是NaOH的碱裂解法
查了下，和这个http://shiyan.ebioe.com/3838.htm
差不多，只不过没他这个复杂，当时只是小题鉴定，没后面的RNA酶的部分。

[ Last edited by telomerase on 2012-4-3 at 14:15 ]

我的路靠我的脚踩出来！！！不走寻常路！！！

13楼2012-04-03 13:49:42

查看全部 17 个回答

atlanticwi

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嗯................
是指提基因组DNA吗？为何说是PCR提取试剂盒？是指胶回收盒子？

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2楼2012-03-30 20:43:22

danyzj01

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引用回帖:

2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-30 20:43:22:
嗯................
是指提基因组DNA吗？为何说是PCR提取试剂盒？是指胶回收盒子？

就是DNA模版提取

3楼2012-03-30 22:59:53

atlanticwi

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小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 很详细了 2012-03-31 09:37:57

嗯..................
那么是说CTAB法提取DNA吧
那么我贴我自己的方案了:
Reagents:
CTAB Extraction Buffer: 50 mL
2 %(V/V) CTAB--------1.000 g
100mM Tris-Hydrochloric acid(pH 8.0)--------0.605 g
1.4M Sodium chloride--------4.091 g
20mM EDTA•Na2--------0.372 g
Sterilize reagent and store at -4 °C
----------------------------------------------------------------------------------------------------
Wash Buffer: 20 mL
76 % Ethanol--------15.2 mL Anhydrous ethanol
10mM Ammonium acetate--------0.015 g
Distill water--------up to 20 mL

自个有把Protocol翻译成英文的习惯，所以你凑合的看吧，这是用于我们提植物基因组DNA用的，不知是否能用于你的实验
希望有所帮助

若有错的话请高手指正

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4楼2012-03-30 23:19:17