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zhu_linying

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr 带好宽啊!苦恼,求助ing!

我从土壤中提取总DNA,用细菌通用引物F338-GC/R518,最近pcr出来的结果有两条离的很近的带,目的条带很宽,温度梯度都做了55-66,都是有两条很近的带,求高手相助,万分感谢!!
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zcc3255

木虫 (正式写手)

熊猫

【答案】应助回帖


zhu_linying: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-03-22 21:55:16
引用回帖:
7楼: Originally posted by cnb1987 at 2012-03-20 13:15:23:
童鞋,在PCR的时候你一定要下功夫在引物设计上,我刚开始做的时候也是这种情况,以前用别人设计的引物,怎么扩都扩不出来,扩出来也是你这种情况,引物的特异性不好,现在自己做实验了,自己设计引物,连本科生上 ...

好好学习吧,PCR的东西太多了,P出来了怎么都对,P 不好原因太多了,程序设计、引物,体系也是很大的问题,
我们原来一直用上海生工的,实验室的都能P出来,偶就P 不出来,郁闷啊,换了隔壁的TAKARA还不行;怕自己操作问题,让同学帮忙一起P 还不行;后来用了宿舍的一个MIX好了,不过条带浓度很低。还好,我只要P出来割胶回收就好了
18楼2012-03-21 18:52:19
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rommel1941

铁杆木虫 (正式写手)

情定山河

★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励应助!欢迎常来哈~ 2012-03-20 12:01:54
建议使用Mg2+浓度,更换电泳缓冲液,将低电压和电泳时间,调整上样量。感觉是有点弥散和拖尾,祝好
将相本无种★男儿当自强
2楼2012-03-20 09:03:00
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gaoxiang6521

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流~ 条带比较小,提高胶浓度是个好办法! 2012-03-20 12:03:02
marker条带也不清楚。除改变PCR条件和体系外,
建议:
1、调整拍照的焦点和焦距,以MERKER条带清晰为标准;
2、做胶时充分熔解,并倒胶半小时后等完全凝固再拔梳子;
3、提高胶浓度。

另:楼主的marker可是DL2000?
3楼2012-03-20 09:30:09
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励应助! 2012-03-20 12:03:26
建议你跑一下page或者是将PCR产物稀释后作为模板再进行一下PCR
4楼2012-03-20 09:40:53
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