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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » pJQ200载体上插入同源臂，三亲结合转入假单胞菌KT2440中
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飞云逐月

金虫 (正式写手)

[求助] pJQ200载体上插入同源臂，三亲结合转入假单胞菌KT2440中

pJQ200载体上插入同源臂，三亲结合转入假单胞菌KT2440中，用Cm和Gm双抗筛选发生单交换的重组菌，为什么效率总是很低？
单交换的菌划线到蔗糖平板，筛选发生双交换的重组菌，达到敲除基因的目的，请问虫友们双交换的概率有多大？做过这方面实验的虫友们请指点一下。
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1楼 2012-03-19 14:33:08
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xhy0016

金虫 (小有名气)
刚开始做都是很低的，因为不太熟练，操作上可能有些问题，多做几次就好了。第一次三亲结合单交换的时候可以适当的降低一下抗生素的浓度，因为这个质粒在KT2440里是严格不复制的，绝对的自杀性。或者，你也可以用电转化的方法试一下。至于二次交换的概率，如果你要敲除的是必须基因的话，那回复突变的概率肯定会大一些的，当然，筛出来的菌还是要进行PCR验证的，以确保敲除确实成功了。我就说这么多了，祝你成功！
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2楼2012-09-17 22:16:02
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黑洞尽头

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xhy0016 at 2012-09-17 22:16:02
刚开始做都是很低的，因为不太熟练，操作上可能有些问题，多做几次就好了。第一次三亲结合单交换的时候可以适当的降低一下抗生素的浓度，因为这个质粒在KT2440里是严格不复制的，绝对的自杀性。或者，你也可以用电转 ...

你好。请问你还在做三亲结合吗？我最近也要做三亲结合，但是我所在的实验室没有操作步骤，所有的条件都要自己来试，所以就想问问可不可以分享分享经验，谢谢！

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3楼2019-04-11 21:34:07
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