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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 过表达
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司马诸葛

木虫 (正式写手)

[求助] 过表达

请问：过表达的外源基因A与内源基因A同源性高达90%，如何确定外源基因A已经表达呢？RT-PCR没法设计特异性引物，WB抗体也没有特异性。。。。愁！

[ Last edited by 司马诸葛 on 2012-3-16 at 15:27 ]
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1楼 2012-03-16 09:32:57
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stfoxst

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, Good! 2012-03-21 18:54:47
带上报告基因呀。比如GFP，这是最通用的策略。
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AndGodsaid,Lettherebelight:andtherewaslight.
2楼2012-03-20 22:41:05
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司马诸葛

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stfoxst at 2012-03-20 22:41:05:
带上报告基因呀。比如GFP，这是最通用的策略。

没有报告基因！怎么办？
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3楼2012-03-21 13:08:59
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bbwalkman

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶切加入到报告基因的质粒里面呢 然后不就知道了
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4楼2012-03-21 14:57:09
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司马诸葛

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bbwalkman at 2012-03-21 14:57:09:
酶切加入到报告基因的质粒里面呢 然后不就知道了

基因已经插入基因组中了，你是说酶切基因组DNA吗？这个可行吗。。。。
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5楼2012-03-21 16:13:26
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bbwalkman

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 司马诸葛 at 2012-03-21 16:13:26:
基因已经插入基因组中了，你是说酶切基因组DNA吗？这个可行吗。。。。

如果不要求表达自身内源基因的基础上，可以把内源基因酶切破坏一下试试呢 然后看看外源基因有没有表达
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6楼2012-03-21 16:22:01
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司马诸葛

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bbwalkman at 2012-03-21 16:22:01:
如果不要求表达自身内源基因的基础上，可以把内源基因酶切破坏一下试试呢 然后看看外源基因有没有表达

内源基因怎么破坏啊？我是过表达，不是去表达？？
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7楼2012-03-21 16:29:40
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bbwalkman

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+3, 很热心哈！ 2012-03-21 18:55:16
司马诸葛: 金币+5, ★有帮助 2012-03-22 08:34:46
那你做空白对照了么？两者没区别？
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8楼2012-03-21 16:43:35
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司马诸葛

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by bbwalkman at 2012-03-21 16:43:35:
那你做空白对照了么？两者没区别？

对照就是没有表达外源基因的，仅表达内源自己的。
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9楼2012-03-22 08:33:16
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stfoxst

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
司马诸葛: 金币+10, 那你觉得蛋白质水平，该怎么证明是否过表达呢？ 2012-03-22 19:54:36
引用回帖:
3楼: Originally posted by 司马诸葛 at 2012-03-21 13:08:59:
没有报告基因！怎么办？

楼主在实验设计之初可能没有考虑到后续的问题。应该找你导师去，这是他的失职
如果有时间的话，建议补充一部分实验。比如构建p-A基因-IRES-EGFP载体，转染细胞，筛选阳性细胞株后继续后续实验。
如果快毕业了或者懒得做，就只有用定量PCR对比过表达细胞株和对照组的A转录水平了。如果A的mRNA大幅度升高，也可以算是你的过表达成功了。
我不知道你的实验目的，上述的方法是比较通用的策略。
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AndGodsaid,Lettherebelight:andtherewaslight.
10楼2012-03-22 11:23:45
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