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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切
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yeshui

铁虫 (小有名气)

[求助] 双酶切

我的片段与质粒连接后，转到DH5α中，后提质粒，进行双酶切验证，和PCR验证，PCR能出现目的条带，可是双酶切切不来是怎么回事呢？不解，请大家多多指教啊
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1楼 2012-02-27 21:28:52
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yeshui

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 快乐的小傻瓜 at 2012-02-29 22:15:25:
不连接的质粒也能p出来……什么原因呢？pcr阴性对照咋做啊

麻花13的意思是LB板上残留了目的片段，做PCR就会P出来，阴性对照是以没做转化的DH5α做模板，应该是这意思吧
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12楼2012-03-01 09:55:05
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励 2012-02-28 08:15:54
你的阳性克隆多吗？
如果所有的阳性克隆都是这个样，那么有可能是PCR假阳性（PCR验证时有阴性对照吗？）
或者你的克隆方案是否有问题，导致酶切连接后酶切位点消失？
如果有更详细的信息，可以再分析
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yeshui
2楼2012-02-27 21:43:34
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小丹木木

荣誉版主 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by panda73 at 2012-02-27 21:43:34:
你的阳性克隆多吗？
如果所有的阳性克隆都是这个样，那么有可能是PCR假阳性（PCR验证时有阴性对照吗？）
或者你的克隆方案是否有问题，导致酶切连接后酶切位点消失？
如果有更详细的信息，可以再分析

假阳性是经常出现的，所以多做几个吧，呵呵
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3楼2012-02-28 08:16:42
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yeshui

铁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by panda73 at 2012-02-27 21:43:34:
你的阳性克隆多吗？
如果所有的阳性克隆都是这个样，那么有可能是PCR假阳性（PCR验证时有阴性对照吗？）
或者你的克隆方案是否有问题，导致酶切连接后酶切位点消失？
如果有更详细的信息，可以再分析

转化的LB板上克隆很少，而且都是在边上长的，进行菌落PCR筛选都是阳性，但是再划到含有抗生素的LB板上大多数不长，只有一个长了，我上述做的就是长的那个。菌落PCR是用片段引物筛的
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4楼2012-02-28 08:49:50
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