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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 影响酶切的几个主要因素
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panda73

金虫 (小有名气)

[交流] 影响酶切的几个主要因素 已有7人参与

影响酶切的几个主要因素：
1. 质粒DNA的质量
1）质粒DNA的质量是决定酶切效率的最最要的因素。通常在克隆时，如果反复优化酶切条件后，都不能实现完全酶切，最可能的原因就是质粒DNA的质量有问题。
2）DNA的质量监测通常有两个方法：首先OD260/OD280比值应该在1.8左右（1.7-1.9），否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。其次，琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主。最多不超过三条带（分别为超螺旋DNA，线性化DNA和环状DNA）。否则意味质粒DNA的质量不高，应该重新制备。

2.限制性内切酶的活性
1）限制性内切酶一般需要低温保存，而且反复的升降温过程对酶活性的损害很明显。因而为了确保在有效期内的限制性内切酶不会失活，限制性内切酶的日常保存和使用应当很小心。
2）建议购买具有保温功能的冻存盒保存限制性内切酶（-20度），而且取用限制性内切酶时，也应该使用具有保温功能的冻存盒，尽量防止酶的温度反复出现大的波动。

3.限制性内切酶的用量
1）限制性内切酶的单位定义通常为：在合适的温度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定义为一个单位。
2）在这个单位定义中，有几个不确定因素：首先是底物，不同的酶单位定义是选择的底物可能不同（常用的几个底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些质粒DNA）；第二个不确定因素是限制性内切酶在底物DNA上的酶切位点的个数。由于单位定义中要求完全消化，因而底物上某个酶的酶切位点的个数的多少，就直接影响了该酶的单位定义。
3）因而，在进行酶切时，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科学的，这也导致在实际工作中，大家要进行多次预实验才能确定最合适酶切条件。
4）以前，我推荐了一个在线的双酶切设计软件，double digestion designer, 可以精确地计算酶切时的限制性内切酶的用量。使用中，能够注意到，用来进行双酶切的两个酶的用量有时竟然相差近20倍（EcoRI + NheI)，而且发现，小片段PCR产物（100-500bp）进行酶切时，需要的酶量比质粒DNA酶切时用量多10倍以上。
5）该软件目前可以免费使用，用户名和密码都是test。http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php

[ Last edited by panda73 on 2012-2-27 at 16:42 ]
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酶切专家

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1楼 2012-02-27 16:40:42
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chibang1220

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶切现问题，看内切酶说明书，相应试剂公司目录。不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，。
可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基  ，同尾酶、同裂酶   

1. 酶切不开或不完全
1.1 质粒问题 纯度差或残留酶切抑制物最为常见 。杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等；【重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂，
1.2 酶的问题：确认内切酶有效 [很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。确认酶切效果不好，做标记，更换] 。

【题外话：用内切酶注意】
a. 内切酶如无特殊要求，保存-20~-30度。并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。

b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。这点大家都清楚，不过多强调也没坏处。因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。

c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。有时我们可以发现，即使是-20~-30度放置，酶仍然会冻结。个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。此外，有时由于操作不小心，冰盒上凝结的一些碎冰掉在酶管里了（我自己出现过两次，汗....）

d. 吸取酶时的tips。我们常用来取酶的tips都是最小的那种，适合2ul和10ul的枪，但tips通常有两种，一种是最常用的短的tips，用它取酶时，tips挨着酶液后，枪几乎是要插入管子，有时会在枪身上沾上酶液。因此，可能会产生污染。那么我们必要非常注意动作，要么就换用另一种长的 tips，专门去酶液用。

1.3 buffer问题。有些酶切的buffer中，添加了一些较为容易析出或溶解的成分[连接酶的buffer更是这样]，有时酶切的buffer没有完全融化时，buffer的浓度是不均一的。新的buffer先融化的部分，盐离子浓度要高，使用一段时间后，融化部分的离子浓度会变低。通常，这种影响不大，但如果是使用一些对离子浓度敏感的内切酶时就会出现问题。

1.4 双酶切的buffer选择：确认使用的是正确的buffer和反应温度[具体可以参考各厂家提供的酶切buffer以及双酶切buffer的资料，其中，NEB的可以参见
http://www.neb-china.com/cn/tech/re/double_digests.htm
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人的差别在于业余时间
14楼2012-04-17 22:19:40
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酶切专家

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
这才是专家，惭愧，惭愧
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2楼2012-02-28 10:57:03
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十口心思

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
小丹木木(金币+1): 鼓励交流 2012-02-29 08:18:11
得看用什么牌子酶了，现在的酶如NEB的HF酶，MBI的FAST酶都很好，无论切质粒还是PCR产物效率都很好。不用考虑那么多，也用不了那么多倍。质粒别降解了就行，至于两条带还是三条带，做个克隆无所谓。现在用盒子提的质粒，纯度都还不错。还有是任何生物反应不可能达到完全，酶切反应不能实现完全酶切的，无论你怎么优化。金无足赤。
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3楼2012-02-29 01:11:50
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panda73

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 十口心思 at 2012-02-29 01:11:50:
得看用什么牌子酶了，现在的酶如NEB的HF酶，MBI的FAST酶都很好，无论切质粒还是PCR产物效率都很好。不用考虑那么多，也用不了那么多倍。质粒别降解了就行，至于两条带还是三条带，做个克隆无所谓。现在用盒子提的 ...

做一个克隆是可以无所谓，一周不行，可以两周，甚至三周时间去做。但如果要做很多个克隆呢，或者想建一个高质量的库呢。
当然，这些只是交流，仅供参考
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4楼2012-02-29 09:53:34
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