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yicao917

木虫 (小有名气)

[求助] 求支原体培养基的配方即培养条件

求支原体培养基的配方即培养条件
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1楼 2012-01-16 00:08:22
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ecolibl21

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yicao917(金币+10): ★★★★★最佳答案 2012-01-16 10:15:20
scelab(金币+5, MicEPI+1): 谢谢热心回复哦~ 2012-01-16 13:31:09
amisking(MicEPI-1): 2012-01-16 17:56:10
参照其他相关资料：
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支原体又称霉形体，是很小的原核细胞，完全没有细胞壁．菌体形态多变，具高度多形性，球形、梨形、分枝的或螺旋的丝状等。营养要求苛刻，在高血清量的复杂培养基上生长，在固体培养基上菌落呈油煎荷包蛋样特征性外观。

培养基：牛心汤复合培养基等。分离培养：无菌采取肺、肝、脾、肾组织，直接剪成小块放在固体培养基上划一直线，再用无菌铂耳环在与其垂直方向划线，或者将组织块剪碎磨成匀桨，经液体培养基连续系列稀释后培养．若当液体材料为牛乳、排泄物、胎液等，可直接取0.2ML接种于液体培养基或取0.1ML接种于固体培养基。固体琼脂平板置37摄氏度潮湿需氧条件或在５％二氧化碳下培养48-96h,用斜射光或放大25-40倍的立体显微镜检查,若有特异菌落出现,应选取散在的单个菌落用无菌解剖刀切下小琼脂块,用巴氏吸管小心地将菌落和周围琼脂吸入,再将其移入盛有2-3ML的液体肉汤培养管培养48h,将其培养物通过0.45微升孔径大小的滤膜过滤后作1:10和1:100稀释,每一个稀释液取0.05ML涂布于几个琼脂平板,即可得到纯的支原体培养物。

牛心汤复合培养基：
　　牛心汤1000ml
　　蛋白胨10g
　　氯化钠5ml
　　酵母提取液10ml
　　无菌马血清200ml
　　1.25%醋酸铊溶液20ml
　　青霉素200IU/ml

实验 支MP 肺炎支原体培养实验

一、标本采集

支原体常侵及人和动物的粘膜表面，一般可用棉花拭子涂抹取样后放入2~3ml支原体液体培养基的小管中，或取其分泌液，若标本是组织块，可在灭菌乳钵或玻璃匀浆后接种，取样后应尽快接种培养。

二、分离培养

1、支原体固体培养基接种法 转动拭子将标本液体尽量挤出，用无菌滴管吸1~2滴接种在平皿上盖好，用L棒涂抹或倾斜转动平皿使标本均匀分布，置37℃孵育。

2、支原体半固体培养基接种法 混种法：在制备半固体培养基时，培养基加热溶化，温度降至50℃时，添加动物血清、酵母浸液及青霉素后混匀，待冷却至37~40℃时，用无菌滴管吸取标本0.5~1ml加入培养基中，充分混匀，凝固后置37℃孵育。

3、穿刺接种法：方法同细菌接种法。

三、结果观察
　　绝大多数支原体为兼性厌氧，少数在含10% CO2和相对湿度80~90%的大气环境中生长良好。支原体生长缓慢，多数于3~4d长出菌落，少数于1~2w方长出典型菌落，在平皿固体培养基上生长的菌落呈"油煎蛋"状，边缘不整齐。

四、附录
　　糖酵解培养基（肺炎支原体培养基）
　　基础培养基 70ml
　　马（或牛血清） 20ml
　　25%酵母浸液 10ml
　　0.4%酚红 0.5ml
　　1%醋酸铊 2.5ml
　　青霉素10000IU/ml 5.0ml
　　调pH 7.8
　　肺炎支原体培养很简单的，特别是液体培养，不需要防护！
　　配方上面的有点复杂而模糊，简单：
　　PPLO 21g（商品化买）
　　酵母粉 6g（OXIDE）
　　马血清 200ml（没有的话用小牛血清代替）
　　L－半胱氨酸 0.3g
　　葡萄糖 10g
　　1%酚红 4ml
　　AMP 若干（0.1－0.2g，多加点不影响，但醋酸铊有毒性的，我不加）
　　这些够了，我有时还加SMZ和TMP！
　　ph要调的，大概在7.5－7.6之间吧！
　　酚红可以高压的！
其二

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1.4 ％PPLO琼脂培养基
[用途]
分离支原体
[配法]
牛心（去脂绞碎）250g ，氯化钠5g，胰蛋白酶（不含乳糖）2.5g，蛋白胨10g ，酵母浸膏1g ，琼脂粉14g ，蒸馏水1L。
（1）    牛心消化液配制：取去脂绞碎牛心250g ，氯化钠5g及蒸馏水900ml混合；另取胰蛋白酶2.5g，溶解于100ml 5g / L 氯化钠溶液中，然后与上述牛心消化液混合，放置50-60 ℃ 水温箱内消化2h ，中间不断搅拌消化后用两层纱布过滤，滤液煮沸5min ，用滤纸过滤后，补足水分至原量，然后加酵母浸膏1g ，混匀，冷却后调pH 至8.0 ，分装后121 ℃ 灭菌15min 备用。
（2）    支原体基础琼脂：取上述牛心消化液（已加氯化钠）1L，加蛋白胨10g 和琼脂粉14g ，混合后，加热溶解调pH 至7.8-8.0，再加热煮沸，用脱脂棉或绒布过滤，过滤后分装于圆瓶中，每瓶70ml，121 ℃ 灭菌15min 备用
（3）    250g / L 鲜酵母液制备：食用鲜酵母块250g ，加蒸馏水1L ，混合后，煮沸2min ，用滤纸过滤，滤后置4 ℃ 冰箱中过夜，使之沉淀，次日吸取上清液，用150g / L 氢氧化钠溶液调pH 至8.0，再煮沸1 次，冷却后，3000r／min 离心45min ，吸取上清液，分装于瓶中，121 ℃ 灭菌15min ，放4 ℃ 冰箱中备用，可保存3 月。
（4）    倾注平板：溶解基础琼脂，冷却至80 ℃ 左右，每瓶（70ml）内立即加预温在37℃ 培养箱内的无菌马血清或小牛血清20ml , 250g / L 鲜酵母浸出液10ml，10g / L 乙酸铊溶液2.5ml ，青霉素G 钾盐溶液（20 万U / ml )0.5ml 和两性霉素B 溶液（5mg／ml）0.1ml；充分混匀后倾注9cm平板，经37℃ 培养过夜，无菌试验阴性者，存放4 ℃ 冰箱备用
注：
(1)乙酸铊是极毒药品，须特别注意安全操作
(2)   支原体美蓝琼脂平皿为分离肺炎支原体的选择性平皿，口腔、唾液分泌物中的其它支原体均被抑制生长，肺炎支原体生长为“桑椹状”无色的菌落
(3)   支原体传代、移种用0.1 ％半固体琼脂，配制时除用0.1 ％琼脂粉外，其它成分与支原体基础培养基相同，但不加两性霉素，此半固体琼脂分装在试管内灭菌备用。传代时将平皿上已选定的支原体菌落用无菌刀片切下一小块，直接移种于半固体管中，置适当的气体环境中，培养3-5 天后，可在琼脂小块出现“小岛状”絮片生长物，或呈颗粒状，即次代支原体
(4)   支原体传代用液体培养基：其成分与上述支原体半固体琼脂相同，不加琼脂粉和两性霉素B 。
2 肺炎支原体分离用双相培养基
[用途]
用于喉拭标本直接分离肺炎支原体
[配法]
(1)底层琼脂斜面：其成分与上述支原体半固体琼脂相同，不加两性霉素B 。无菌分装于经灭菌的链霉素空瓶中，每瓶3ml，置成斜面，此为底层
(2)   液体培养基：其成分与上述支原体传代用液体培养基相同。但在未高压灭菌前，再加入葡萄糖1g ，美蓝0.001g （即10g / L 美蓝溶液0.lml）, 1g / L 酚红溶液2ml , 115 ℃ 灭菌15min ，冷却后，再加入辅助成分和防止杂菌生长的成分。然后，在上述底层琼脂斜面上，每瓶再加入液体培养基3-5ml，瓶塞用煮沸灭菌的后口橡皮塞经37℃ 培养过夜，无菌试验阴性者，存放4 ℃ 冰箱中备用，可保存1 月
注：已接种的双相培养管，培养37℃ 普通环境2-4 周，观察结果，阳性生长见双相管由淡紫色变成绿色再转变为黄色，因肺炎支原体发酵葡萄糖，还原美蓝。取阳性管用分离支原体固体平皿分离菌落，平血放入含95 ％氮气和5 ％二氧化碳环境中，或放入含5%二氧化碳环境中培养2-4 周，阳性平皿可见菌落生长
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另，有很多商品化培养基可以购买。不同培养基培养条件可能有所不同。
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PCR发明人穆利斯的成功表明，想象力推动进步
2楼2012-01-16 09:36:21
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