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fangfang0044木虫 (小有名气)
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[求助]
关于蛋白酶活性测定的问题，求解~
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| 最近再做一个有关胰酶的活性测定的实验，看文献有用到蛋白底物N-succinyl-l-ala-l-ala-l-pro-l-phe-p-nitroanilide (AAPF-NA)（中文名：N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酸-4-硝基苯胺）作为活性测定的底物。但没有具体的有关标区的建立及测定的方法，求高手指点~ |
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至尊木虫 (文坛精英)
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中华人民共和国专业标准 蛋 白 酶 活 力 测 定 法 SB/T 10317-1999 Measurement of proteinase activity ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。 1 福林法 1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯 1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O) 100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。 取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min, 以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再 煮沸除去之。冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。此溶 液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。 1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL。 1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL。 1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即 成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成 0.2mol溶液(B液)。 取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。 1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在 水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即 成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。 1.1.6 100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐 步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10 mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使 用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。 1.2 仪器 a. 分析天平: 感量0.1mg; b. 581-G型光电比色计或72型分光光度计; c. 水浴锅; d. 1、2、5、10mL移液管等。 1.3 操作 1.3.1 标准曲线的绘制 1.3.1.1 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。 表 1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 ━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ┃ 管 号 试 剂 ┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━ ┃ 1 ┃ 2 ┃ 3 ┃ 4 ┃ 5 ┃ 6 ━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 蒸馏水,mL ┃10 ┃ 8 ┃ 6 ┃ 4 ┃ 2 ┃ 0 100μg/mL酪氨酸,mL ┃ 0 ┃ 2 ┃ 4 ┃ 6 ┃ 8 ┃ 10 酪氨酸最终浓度,μg/ml ┃ 0 ┃ 20 ┃ 40 ┃ 60 ┃ 80 ┃ 100 ━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━ 1.3.1.2 测定步骤:取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各加入0.4mol 碳酸钠5mL,再各加入已稀释的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中。40℃保温发色20min在 581-G型光电比色计上分别测定光密度(OD) (滤色片用65**#)或用72型分光光度计进行 测定(波长660nm)。一般测三次,取平均值。将1～6号管所测得的光密度(OD)减去1号管( 蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净OD数。 为了清楚起见。再列出表格如下 (表2)。 表 2 ━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ┃ 管 号 试 剂 ┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━ ┃ 1 ┃ 2 ┃ 3 ┃ 4 ┃ 5 ┃ 6 ━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 按表1制备的不同浓度酪氨酸,mL┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 0.4mol/L Na2CO3,mL ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 福林试剂,mL ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━┳━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ ┃ 1 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ ┃ 2 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ O D值 ┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ ┃ 3 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ ┃ 平均 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ━━━━━━━━━━┻━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 净O D值 ┃ 0 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ━━━━━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━ 以净O D值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线(或可求出每度OD所相 当的酪氨酸量K)。 1.3.2 样品稀释液的制备。 1.3.2.1 测定酶制剂: 称取酶粉0.100g,加入pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL,吸取此 液5mL,再用缓冲液稀释至25mL,即成5000倍的酶粉稀释液。 1.3.2.2 测定成曲酶: 称取充分研细的成曲5g,加水至100mL,在40℃水浴内间断搅拌 1h,过滤,滤液用0.1mol pH 7.2磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数(估计酶活力而定)。 1.3.3 样品测定: 取15×100mm试管3支,编号1、2、3(做2只也可),每管内加入样品 稀释液1mL,置于40℃水浴中预热2min,再各加入经同样预热的酪蛋白1mL,精确保温 10min, 时间到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以终止反应,继续置于水浴中保温20min,使 残余蛋白质沉淀后离心或过滤,然后另取15×150mm试管3支,编号1、2、3,每管内加入滤 液1mL,再加0.4mol碳酸钠5mL,已稀释的福林试剂1mL,摇匀,40℃保温发色20min后进行光 密度(OD)测定。 空白试验也取试管3支,编号(1)、(2)、(3),测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加 0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。 为了清楚起见,分别列出表格于下 (见表3及表4)。 表 3 ━━━━━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━ ┃ 管 号 ┃ 试 剂 ┃ 管 号 试 剂 ┣━┳━┳━┫ ┣━━┳━━┳━━ ┃1 ┃2 ┃3 ┃ ┃(1) ┃(2) ┃(3) ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━ 预热酶液, mL ┃1 ┃1 ┃1 ┃预热酶液, mL ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━ 预热2%酪蛋白, mL ┃1 ┃1 ┃1 ┃0.4mol三氯乙酸, mL ┃ 2 ┃ 2 ┃ 2 ━━━━━━━━━━┻━┻━┻━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━┻━━ 作用10min (精确计时) ┃作用10min (精确计时)┃ ┃ ━━━━━━━━━━┳━┳━┳━╋━━━━━━━━━━╋━━╋━━┳━━ 0.4mol三氯乙酸, mL ┃2 ┃2 ┃2 ┃预热2%酪蛋白, mL ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━┻━┻━┻━┻━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━ 表 4 ━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━ ┃ 管 号 试 剂 ┣━┳━┳━━┳━━┳━━┳━━━ ┃1 ┃ 2┃ 3 ┃(1) ┃(2) ┃ (3) ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 滤 液, mL ┃1 ┃ 1┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 0.4mol Na2CO3,mL ┃5 ┃ 5┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ┃ 5 ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━ 福林试剂, mL ┃1 ┃ 1┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ┃ 1 ━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━ O D值 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ━━━━━━━━━━╋━┻━┻━━╋━━┻━━┻━━━ 平均O D值 ┃ ┃ ━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━ 净O D值 ┃ ┃ 0 ━━━━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━ 样品的平均光密度(O D)一空白的平均光密度(OD)=净OD值。 1.4 计算 在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。 A 1 样品蛋白酶活力单位(干基)=━━×4×N×━━━ ……………………… (1) 10 1 - W 式中:A——由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或OD值×K); 4——4毫升反应液取出1 mL测定 (即4倍); N——酶液稀释的倍数; 10——反应10min; W——样品水分百分含量。 1.5 注意事项 以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶(pH7.2)。若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶, 则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的pH缓冲液换成相应pH缓冲液即可。现把几种常用pH 缓冲液配方提供如下: 1.5.1 pH7.5磷酸盐缓冲液 (0.02mol/L) 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠 (NaH2PO4·2H2O)0.5g以蒸 馏水溶解定容至1000mL。 1.5.2 pH 2.5乳酸-乳酸钠缓冲液 (0.05mol) A 液: 称取80%～90%乳酸10.6g,加蒸馏水稀释定容至1000mL。 B 液: 称取70%乳酸钠16g,加水稀释定容至1000mL。 取A 液16mL与B 液1mL混合稀释一倍即成。 1.5.3 pH 3.0乳酸-乳酸钠缓冲液 (0.05mol) A 液: 称取80%～90%乳酸10.6g,以水定容至1000mL。 B 液: 称取70%乳酸钠16g,蒸馏水溶解定容至1000mL。 取A 液8mL与B 液1mL,混合稀释一倍即成。 1.5.4 pH 10硼砂-氢氧化钠缓冲液 A 液: 称取硼砂19.08g,用蒸馏水溶解定容至1000mL (0.05mol)。 B 液: 称取氢氧化钠8g,用蒸馏水溶解定容至1000mL (0.2N)。 取A 液250mL,B 液215mL混合,用蒸馏水稀释定容至1000mL即成。 1.5.5 pH 11.0硼砂-氢氧化钠缓冲液 A 液: 称取硼砂19.08g,用蒸馏水定容至1000mL 。 B 液: 称取氢氧化钠4g,用蒸馏水定容至1000mL 。 取A 液与B 液等量混合。 1.5.6 2%酪蛋白溶液配成酸性时,须先加数滴浓乳酸,使之湿润以加速其溶解。 2 甲醛法 成曲蛋白酶活力的测定,如用福林法测定确有困难时,可用甲醛法测定作过渡。 2.1 仪器 a. 分析天平:感量0.01g; b. 水浴锅; c. 电烘箱; d. 容量瓶、吸管、滴定管等。 2.2 试剂与溶液 a. 1%酚酞指示剂; b. 0.1%麝香草酚蓝; c. 0.1N氢氧化钠液、甲醛(试剂配制法同氨基态氮的测定,见ZB X 66038—87《氨 基态氮测定法》)。 2.3 操作 2.3.1 目测法 称取研细均匀的成曲样品10g,放入250mL锥形瓶中,加55℃温水80mL,充分摇匀,置于 55℃水浴锅中保温3h,取出后加热煮沸以破坏酶活力,冷却后定容至100mL,充分摇匀后以 脱脂棉过滤,吸取滤液10mL,移至150mL锥形瓶中,加水50mL, 1%酚酞指示剂0.2mL,以0.1N 氢氧化钠标准溶液滴定至刚显微红色(pH 8.2),记下滴定数作为总酸,继续加甲醛10mL,用 0.1N氢氧化钠液滴定至深红色(pH 8.5)为终点,若再加麝香草酚蓝1mL作指示剂,则滴至紫 红色为终点。记下滴定数,减去空白数后计算成氨基态氮。另称取曲10g做水分,再折算成 干基数。 2.3.2 酸度计法 所用仪器、药品、操作方法等与氨基态氮测定法同 (见 ZB X 66038-87)。 2.4 计算 蛋白酶活力 (克氨基态氮/100g)(干基) (V-***Vo)×N×0.014 100 =━━━━━━━━━━×━━━ ……………………………… (2) 10 1 -W 10×━━━ 100 式中:V——加入甲醛后氢氧化钠标准液滴定数, mL; ***Vo——甲醛空白滴定数, mL; W——曲水分,%; N——氢氧化钠标准溶液的当量数,N; 0.014——氮的毫克当量数。 ━━━━━━━━━ 附加说明: 本标准由商业部副食品局提出。 本标准由上海市酿造科学研究所起草。 本标准主要起草人须凤高。 ━━━━━━━━━ *本法实质上是在一定温度下、一定时间内,成曲利用自身的蛋白酶把自身原料中的蛋 白质水解成氨基酸。以测定氨基态氮的量来衡量蛋白酶活力的数值。在培养和堆放过程, 环境温度和自身含有水分,故已有少量氨基酸生成。为了能和福林法的酶活力进行对照, 可用空白试验以扣除此误差,方法是另取一曲样于开始时即将成曲酶活杀灭,其余操作步 骤完全相同。杀酶的方法是把已煮沸的蒸馏水70mL倾入10g成曲中,并马上继续把成曲液 煮沸几分钟,其余操作与样品同,成曲和甲醛的空白一起算成Vo。 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 中华人民共和国商业部1987-11-20批准 1988-07-01实施 |
2楼2012-01-02 10:26:23
fangfang0044
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3楼2012-01-02 10:55:58
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