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掌心樱小桃金虫 (小有名气)
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[求助]
大家圣诞节快乐，请教拟南芥DR5 GUS活性问题~
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| 请问如何DR5 GUS活性定量呢？我看了很多文献都是定性的，放了很多图片上去，请问有没有知道如何定量呢？有相关的文献能不能发给我看看，感激不尽！~ |
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【答案】应助回帖
掌心樱小桃(金币+1): ★★★★★最佳答案 2011-12-29 11:45:19
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(1)取100mg植物样品在液氮中研磨成粉末，加入3倍体积的GUS提取缓冲液，再研磨2min, 将粉末装入1.5m1离心管，摇动5min, 12,000rpm, 40C离心10min，取上清4℃保存备用。 (2)蛋白标准曲线的制作取配制的25ug/ml BSA母液，按下表进行BSA梯度稀释: 从中取4ml加入lml考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置2min,测定595nm的光吸收值，制作标 准曲线。 (3)样品蛋白含量测定取蛋白上清Xul，加水至4ml，加入I ml考马斯亮蓝染液，混匀，室温 放置2min,测定595nm的光吸收值，根据蛋白标准曲线计算样品蛋白含量。 3.4.25.2.2 GUS荧光检测 (1)制作4-MU标准:配制4-MU梯度浓度液(由反应终止液配制)l0umol/I, 2.5umol/I, lumol/I, 500nmol/I, 100nmol/l, 10nmol/I:在激发光365nm，发射光455nm,狭缝3nm条件下，测定各样 品的荧光值，绘制标准曲线。 (2)酶反应:取40u1蛋白上清，加入400ul反应缓冲液里(37℃预热)，立即取100u1加入到900u1 反应终止液(0时的空白对照)，37'C温浴，严格定时，10min, 30min和60min各取100ul，加入 900u1反应终止液。测定荧光值。根据标准曲线，计算各样品酶活。 GUS提取缓冲液:50mM磷酸钠缓冲液(PH7.0), lOmMEDTA, 0.1% Triton X-100, O.I%SDS,l Ommp一疏基乙醇，4℃保存。 反应缓冲液:GUS提取缓冲液，加入1MM MUG, 40C避光保存，可保存2周。 反应终止液:0.2M Na2CO3, 考马斯亮蓝G250溶液:考马斯亮蓝G250 10mg, 95%乙醇5m1, H3PO4IOml，定容至l00ml，过滤后4℃保存。 25ug/ml BSA: 2.5mg BSA+0.5ml GUS提取缓冲液，定容至loom], GUS检测液‘50mM磷酸钠缓冲液(PH7.0), 0.5MM K3[Fe (CN) c], 0.5mM Ka[Fe (CN)。]， lOmM EDTA, 0.5mg/ml X-Gluc, 40C避光保存 具体安照自己的具体情况适当更改 |
4楼2011-12-29 10:24:18
掌心樱小桃2楼2011-12-26 22:23:14
掌心樱小桃
金虫 (小有名气)
- 应助: 3 (幼儿园)
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- 散金: 320
- 红花: 6
- 帖子: 186
- 在线: 105.5小时
- 虫号: 980700
- 注册: 2010-03-24
- 专业: 土壤学
3楼2011-12-28 16:24:35
5楼2016-01-19 13:53:33
