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求索寻觅

金虫 (小有名气)

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专业: 蛋白质组学

[求助] 大家帮忙分析下双向电泳结果不好的原因（有图）

裂解液配方是：7M尿素，2M硫尿，4%CHAPS，0.3% Bio-lyte，65 mM DTT，加入了罗氏蛋白酶抑制剂。大鼠肝脏在液氮中研磨，大约0.1 g肝脏加入了1ML裂解液，然后冰浴超声了1分钟（就是放进去超声零点几秒然后拿出1秒，再放进去，搞了1分钟）。冰上裂解1h后，35000 g离心 90 min（这个转速已经是我们实验的极限了）。吸取上清做后续实验。
测定了蛋白浓度大概为20mg/ml，水化时吸取了100ul 加入400ul 水化缓冲液（水化缓冲液配方和裂解液一致），上样450ul进行水化，我做的是24cm的胶条，ph 3-10。我做了三根胶条，2根在水化缓冲液家了DTT，第三根加了 TBP（据说TBP可以很好的解决碱性端横纹的问题）。水化了大概14h，然后进行等点聚焦。程序如下
100v  缓慢 1h
200v 缓慢 1h
500v 缓慢  1h
  1000v 缓慢 1h
10000v 线性 4h
10000v 快速 100000v.H
500 v 快速  24h
聚焦后用的gel胶为10%的，先用50v，再用200v跑完。
结果如下图，分别为1，2，3，左边是正极端。请大家帮忙分析下原因，不甚感激。
ps：我已经做了几个月了，结果总这样差不多烂，别人论文里面也是这样，但是图谱上蛋白点多很多，也分散的均匀，实在想不明白。

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1楼 2011-12-21 14:26:53

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我的海宝lzy

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

2楼: Originally posted by zjkown at 2011-12-22 06:44:19
碱性端聚焦不好； 100000V.H 好像有点多，可以尝试缩短聚焦V.H数。（缩短后有可能会造成酸性端又聚焦不够，所以可能需要找到平衡点）。二向可以试试4-5%的浓缩胶+10-12%的分离胶。

你好，本人也出现了楼主的情况，不懂到底原因出在哪？希望您能帮忙告知原因，万分感谢!(图片上传不了）——跟楼主情况一样
胶长11cm,ph3-10,G250染色
一向程序：被动水化 12h
200V 5h
500V 1h
1000V 1h
8000V grad 3h
8000V 64000vhr
1000V 10h
二向：恒压 90V 1h
150v 8h
(GE仪器）