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匿名

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1楼 2011-12-20 15:58:47
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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RNA质量挺好的。（条带很锋利，28S与18S之间没有降解的片段，18S底下也没有明显的拖尾）
粗放型我喜欢。
至于你说的18S比28S亮，跟物种、样品取样时期、电泳上样量等都有关系。建议你上样量减少一点，电泳浓度可以配到1.2%甚至1.5%，加大的电压。
不明白为什么这么多人喜欢反转录后通过电泳来检测cDNA。mRNA只占total RNA 3-5%，假如使用3ug total RNA做反转，假设100%反转可以得到90ng 的cDNA。一般marker(5ul)的条带亮度为50ng，但cDNA是弥散（跨度范围大,非集中一条带），加上电泳时染色单链的DNA染色没有双链的亮，你舍得把辛辛苦苦反转得到的全部90ng cDNA拿来跑电泳吗？跑得少又看不见
一般是将反转录产物稀释一定倍数（20倍）用actin的PCR扩增来检测cDNA是否成功合成。
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伟大航线....
7楼2011-12-22 10:20:16
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gaoyang636

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-12-20 18:22:11
你提的什么物种？
图片质量可以，关于条带亮度比例的问题，还是得看你物种；
“反转录一塌糊涂 就没上传”是啥意思，你反转录之后跑胶了？你期望跑胶之后是什么样子的？
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2楼2011-12-20 17:12:23
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匿名

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3楼2011-12-20 19:12:11
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gaoyang636

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

乱七八糟啥样子 下次贴一个看看，也有可能是跑胶的问题哈；
一般反转录结束，我们直接跑一个actin的PCR或者realtime（看起峰圈数），不是直接跑胶的
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4楼2011-12-21 08:47:38
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沾欢欢

金虫 (正式写手)

啦啦啦

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
提RNA的时候,那些枪头啊离心管啊之类的都得用千分之一的DEPC水浸泡12小时,然后再高压灭菌三次以后才能用的~
我提完RNA就测下浓度,然后直接做反转录~
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5楼2011-12-21 14:13:48
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gaoyang636

木虫 (著名写手)
是的，你可以直接拿反转后的模板用，测测浓度适当稀释一下，如果是克隆基因的话，应该还是可以的，我看你的RNA的图还是不错的，没有明显降解
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6楼2011-12-21 15:01:55
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longrna

新虫 (正式写手)
不好意思～ 平时俺一般把mRNA纯化出来的，忘了一般是不用做纯化的。。。。
不过通过电泳来检测也分辨不出哪个是降解的total RNA哪些是你合成的cDNA啊？
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伟大航线....
8楼2011-12-22 10:29:34
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31569218

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般反转录结束，我们直接跑一个actin的PCR。。。。。。
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爱之深痛之切
9楼2011-12-22 11:14:42
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
基本没降解，植物叶片跑RNA就是这个样子
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3934385
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10楼2011-12-22 12:45:32
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