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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 酶促动力学参数测定
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含章冰婵

金虫 (小有名气)

[求助] 酶促动力学参数测定

各位虫友，小女子现在正在做酶的动力学研究，对于同一种底物，反应条件相同，为什么每次得到的Km值不同，有时得到的是6-10mmol/L，有时又是40-60mmol/L，想请问你们在做的时候，都需要注意些什么呢？底物浓度范围以般都怎么选取？
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1楼 2011-11-30 21:37:19
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yhsun8033

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
linyingjia(金币+2): 不错 2011-12-05 19:15:48
含章冰婵(金币+2): 2011-12-18 00:04:02
一般来说，两次测定Km值有3-5倍的差别都是在允许范围内的，楼主两次测定相差将近10倍我觉得可以下从以下两个方面检查：
1. 楼主的测活体系中是不是有不稳定因素，如酶，如果两次用的酶不是一个批次，或者同批次酶放久部分失活了都可能导致这种差别；底物是不是在反应体系中不稳定，容易降解或者失活的等等
2.楼主计算Km时采取什么方法，如果纯手动原始计算，那么双倒数计算时斜率的一点变化就容易对Km的结果产生很大的影响

总之，建议楼主从细节处检查找找原因。
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2楼2011-12-02 13:20:23
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yhsun8033

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

至于底物浓度的选取，可以先看看文献的报道，一般选取在Km值上下10倍的浓度范围
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3楼2011-12-02 13:22:03
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liuyuexinfei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

我们实验室使用最大反应速率一半时底物的浓度即为Km值，我觉得还是很好的，不会偏差这么大吧
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我选择，我喜欢；我喜欢我的选择。
4楼2011-12-02 18:32:17
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含章冰婵

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yhsun8033 at 2011-12-02 13:20:23:
一般来说，两次测定Km值有3-5倍的差别都是在允许范围内的，楼主两次测定相差将近10倍我觉得可以下从以下两个方面检查：
1. 楼主的测活体系中是不是有不稳定因素，如酶，如果两次用的酶不是一个批次，或者同批次酶 ...

谢谢。想和你讨论一个问题，在王镜岩生化书中提到：在一定的反应条件下，Km是不随酶浓度变化而改变，所以对你提到的酶失活会影响Km，我有不解，还请指教。
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5楼2011-12-04 22:46:11
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含章冰婵

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liuyuexinfei at 2011-12-02 18:32:17:
我们实验室使用最大反应速率一半时底物的浓度即为Km值，我觉得还是很好的，不会偏差这么大吧

谢谢哈
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6楼2011-12-04 23:12:31
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yhsun8033

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 含章冰婵 at 2011-12-04 22:46:11:
谢谢。想和你讨论一个问题，在王镜岩生化书中提到：在一定的反应条件下，Km是不随酶浓度变化而改变，所以对你提到的酶失活会影响Km，我有不解，还请指教。

Km值实际上反应的是酶与底物之间的亲和力，所以在理论上酶浓度的变化不会影响Km值的测定。我所说的酶失活影响Km值主要是指如果酶的构想发生变化（有时候反映为部分活性丧失），那么底物与其的亲和力也会发生变化，也就是说Km至会有变化。

如果计算Km值时直接按照最大反应速度一半时的底物浓度来读取时不准的，要按照几个做图法（如双倒数）或者直接由软件（如Prism或者GraFit）计算才准确。
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7楼2011-12-05 16:26:18
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firelion2006

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
含章冰婵(金币+1): 2011-12-18 00:03:46
我觉得km值有一定变化是正常的，我们做一般差两三倍，毕竟两次重复实验不可能保证完全一致，至少手法上也有差别，而细小的差别也会使km值差别很大，还有与计算方法和做斜率选点有关
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使劲搞科研
8楼2011-12-15 22:10:14
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schr_odinger

木虫 (小有名气)
酶活性每一批次的变化很大的，有时就是会变化10倍之多，我做的就是~
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忠于理想，面对现实。
9楼2012-07-31 17:29:34
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
一定要做到差不多饱和，不然10倍差别是很常见的，这不是正常现象而是自摆乌龙。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
10楼2012-07-31 17:54:21
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