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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR 产量低！江湖告急！老板，大侠救命啊！
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晓风残月cl

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我做相对定量是这样的  反转录前测定RNA的浓度和质量
按照20ul反转录体系加2ug的RNA    反转录的效果还可以的
用的invitrogen的盒子
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11楼2011-11-09 19:02:57
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by dls1987 at 2011-11-09 15:10:43:
如你所说，进行20个循环的预扩增，然后以此为模板，补充酶和dNTP，是不是相当于第二种方法，即把PCR产物作为模板继续扩增？还是仅仅需要补充酶和dNTP在原先的管子里，继续下面的15个循环（我一般是跑35个循环）。 ...

这种方法跟第二种方法原理是一样的，补加原先酶和dNTP用量的一半即可，另外最好需要适当增加扩增体系，比如预扩增采用20ul体系，补加完酶和dNTP后可以把体系扩大到30ul，所以你需要补加适量buffer
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12楼2011-11-09 22:02:40
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dls1987

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-11-09 22:02:40:
这种方法跟第二种方法原理是一样的，补加原先酶和dNTP用量的一半即可，另外最好需要适当增加扩增体系，比如预扩增采用20ul体系，补加完酶和dNTP后可以把体系扩大到30ul，所以你需要补加适量buffer

引物也需要再添加，是吗？
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13楼2011-11-10 11:58:41
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mascotte

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

biomeng(金币+5): 试过了没什么大改善。准备换个公司的酶试试 2011-11-15 19:14:29
一般的基因在总RNA中水平不见得很高，并不是一次PCR就可以从cDNA中扩增的很好，所以构建质粒的时候一般都是做巢式PCR扩增目的片段。就是用两对引物进行扩增。第一对引物扩增完成后稀释1000倍，用第二对引物（正反向引物都在第一次PCR扩增的产物范围内）进行第二次扩增。这样的产物特异性高。单次扩增超过30个循环，taq酶的稳定性会降低，造成产物的点突变。利用巢式PCR，每次反应控制在25个循环以内可以减少突变率。
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14楼2011-11-10 14:41:31
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六妖妖

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先确定引物的扩增效率是否最佳。如果引物设计不好，其他的方法优化效果都不会太明显。
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15楼2012-02-15 14:00:26
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