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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR 产量低！江湖告急！老板，大侠救命啊！
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biomeng

银虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR 产量低！江湖告急！老板，大侠救命啊！

江湖告急！老板，大侠救命啊！RNA提出来了，用BIOrad 的反转录盒子做的反转录。根据说明书用2ul cDNA做模板进行PCR. 5个基因有四个p出来了，大小都对。但是现在问题来了，5个中4个产量超低，加10ul跑胶才能看见比较弱的一条带。调整退火温度，Mg 浓度都试了可是还是产量上不去。空白对照也做了，不可能是污染。最搞的是Taq搞得出来，pfu搞不出来。老板能不能帮帮解决一下啊！谢谢！只要pcr产物浓度上去就成
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1楼 2011-11-08 19:33:06
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by dls1987 at 2011-11-09 15:10:43:
如你所说，进行20个循环的预扩增，然后以此为模板，补充酶和dNTP，是不是相当于第二种方法，即把PCR产物作为模板继续扩增？还是仅仅需要补充酶和dNTP在原先的管子里，继续下面的15个循环（我一般是跑35个循环）。 ...

这种方法跟第二种方法原理是一样的，补加原先酶和dNTP用量的一半即可，另外最好需要适当增加扩增体系，比如预扩增采用20ul体系，补加完酶和dNTP后可以把体系扩大到30ul，所以你需要补加适量buffer
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
12楼2011-11-09 22:02:40
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临风7071

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): good 2011-11-08 22:01:20
biomeng(金币+5): 谢谢帮助 2011-11-09 14:44:00
引用回帖:
1楼: Originally posted by biomeng at 2011-11-08 19:33:06:
江湖告急！老板，大侠救命啊！RNA提出来了，用BIOrad 的反转录盒子做的反转录。根据说明书用2ul cDNA做模板进行PCR. 5个基因有四个p出来了，大小都对。但是现在问题来了，5个中4个产量超低，加10ul跑胶才能看 ...

你增大循环数和起始模板量不就行了
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2楼2011-11-08 20:50:47
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丙氨酸密码子

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-11-08 22:01:14
将pcr产物作为模板再跑次PCR。
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3楼2011-11-08 21:23:22
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 专家言简意赅啊！ 2011-11-08 22:01:07
biomeng(金币+5): 1，3都试了。没什么明显效果。2在进行中。谢谢 2011-11-09 14:45:13
有3种方法：
1.加大模板量及增加循环次数
2.以扩出来的产物为模板继续扩增
3.先进行20个循环的预扩增，然后以此为模板，再次补充酶和dNTP进行扩增
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
4楼2011-11-08 21:55:37
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