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chuey

木虫 (小有名气)

[求助] 求助微生物琥珀酸脱氢酶测定问题

到底怎么处理啊,是要上清液还是沉淀啊。线粒体怎么破碎啊 ?
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chuey

木虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by HarveyWang at 2011-10-13 00:14:55:
已经说的很明白了。

你不用离心,直接测破碎液。

谢谢
7楼2011-10-13 08:53:00
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)

海外行者

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+5, MicEPI+1): 强大,学习了 2011-10-11 20:56:17
线粒体测定SDH可以用磷酸缓冲液破碎,pH就用SDH测定反应液的pH即可,一般为pH7.5。就用100 mM的KH2PO4-NaOH冰浴悬浮,超声破碎。一般50-100次超声,每次3sec,间隔5sec。

若破碎液只是测定SDH,则可以再破碎后向其中加入2%的Tween-80,然后震荡几分钟,这样可以充分提取SDH。

SDH 测定需要细胞全液。SDH在细胞破碎液离心上清和细胞沉淀中 都有,都不能忽略。不信,你可以分别测定上清和沉淀的SDH活性看看。
【我一直认为做土匪很性感很坏,很直接,可以大声喊:JCMM我爱你!所以,我自从博士毕业后,就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
2楼2011-10-11 20:07:31
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chuey

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by HarveyWang at 2011-10-11 20:07:31:
线粒体测定SDH可以用磷酸缓冲液破碎,pH就用SDH测定反应液的pH即可,一般为pH7.5。就用100 mM的KH2PO4-NaOH冰浴悬浮,超声破碎。一般50-100次超声,每次3sec,间隔5sec。

若破碎液只是测定SDH,则可以再破碎后 ...

那个要破碎的是直接用菌丝体还是用离心得到的线粒体啊 ?还有那个要用全液的话,好像有悬浮物吧,会不会影响测定结果啊? 问题好像有点多,谢谢了。
3楼2011-10-11 20:29:01
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)

海外行者

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+9, MicEPI+1): 谢谢热心回复~ 2011-10-13 01:00:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by chuey at 2011-10-11 20:29:01:
那个要破碎的是直接用菌丝体还是用离心得到的线粒体啊 ?还有那个要用全液的话,好像有悬浮物吧,会不会影响测定结果啊? 问题好像有点多,谢谢了。

你破碎真菌的菌丝体,就相当于破碎线粒体了。
如果你只想测定线粒体的SDH活性,那么你需要先提取线粒体再测定。

用全液,当然有悬浮物,
关键是你要的是全液的,还是上清的,还是沉淀的SDH活性。

一般来说,测定时20-50uL 测活性就够了。
在反应的保温阶段,样品造成的吸光值背景就稳定了。
而你测定的是吸光值的下降。

我是加入底物启动反应,而不是加入酶液启动反应的。
【我一直认为做土匪很性感很坏,很直接,可以大声喊:JCMM我爱你!所以,我自从博士毕业后,就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
4楼2011-10-11 21:28:13
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