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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 求助微生物琥珀酸脱氢酶测定问题
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chuey

木虫 (小有名气)

[求助] 求助微生物琥珀酸脱氢酶测定问题

到底怎么处理啊，是要上清液还是沉淀啊。线粒体怎么破碎啊 ？
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1楼 2011-10-11 19:21:43
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chuey

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by HarveyWang at 2011-10-11 20:07:31:
线粒体测定SDH可以用磷酸缓冲液破碎，pH就用SDH测定反应液的pH即可，一般为pH7.5。就用100 mM的KH2PO4-NaOH冰浴悬浮，超声破碎。一般50-100次超声，每次3sec，间隔5sec。

若破碎液只是测定SDH，则可以再破碎后 ...

那个要破碎的是直接用菌丝体还是用离心得到的线粒体啊 ？还有那个要用全液的话，好像有悬浮物吧，会不会影响测定结果啊？ 问题好像有点多，谢谢了。
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3楼2011-10-11 20:29:01
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)

海外行者

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+5, MicEPI+1): 强大，学习了 2011-10-11 20:56:17
线粒体测定SDH可以用磷酸缓冲液破碎，pH就用SDH测定反应液的pH即可，一般为pH7.5。就用100 mM的KH2PO4-NaOH冰浴悬浮，超声破碎。一般50-100次超声，每次3sec，间隔5sec。

若破碎液只是测定SDH，则可以再破碎后向其中加入2%的Tween-80，然后震荡几分钟，这样可以充分提取SDH。

SDH 测定需要细胞全液。SDH在细胞破碎液离心上清和细胞沉淀中 都有，都不能忽略。不信，你可以分别测定上清和沉淀的SDH活性看看。
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
2楼2011-10-11 20:07:31
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)

海外行者

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+9, MicEPI+1): 谢谢热心回复~ 2011-10-13 01:00:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by chuey at 2011-10-11 20:29:01:
那个要破碎的是直接用菌丝体还是用离心得到的线粒体啊 ？还有那个要用全液的话，好像有悬浮物吧，会不会影响测定结果啊？ 问题好像有点多，谢谢了。

你破碎真菌的菌丝体，就相当于破碎线粒体了。
如果你只想测定线粒体的SDH活性，那么你需要先提取线粒体再测定。

用全液，当然有悬浮物，
关键是你要的是全液的，还是上清的，还是沉淀的SDH活性。

一般来说，测定时20-50uL 测活性就够了。
在反应的保温阶段，样品造成的吸光值背景就稳定了。
而你测定的是吸光值的下降。

我是加入底物启动反应，而不是加入酶液启动反应的。
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
4楼2011-10-11 21:28:13
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chuey

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by HarveyWang at 2011-10-11 21:28:13:
你破碎真菌的菌丝体，就相当于破碎线粒体了。
如果你只想测定线粒体的SDH活性，那么你需要先提取线粒体再测定。

用全液，当然有悬浮物，
关键是你要的是全液的，还是上清的，还是沉淀的SDH活性。

一般来 ...

我们之前用的方法是把菌丝体用液氮破碎后加入提取液提取液，然后4000转每分钟离心10min，得到上清液再16000转每分钟离心15分钟，然后就留沉淀悬浮了以后测定，如果按照你说的测定全液就是上清液和沉淀一起，那是不是就不用16000转离心了？不好意思，再麻烦一下你！如果可以的话能把你测的方案发给我看看吗？不胜感激！！！
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5楼2011-10-12 20:17:34
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