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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 定量的若干问题，求解答！
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梦想起飞

铜虫 (小有名气)

[求助] 定量的若干问题，求解答！

各位大侠，我要做定量了，还有很多细节不太明白，请大家帮忙解惑啊。
       我做的是细菌，我想知道某一功能基因在某一特殊处理下的表达量与未处理时的差异。这应该是相对定量吧。
        问题一，做定量是要设置内参的，是吧？而我查到的资料基本都是做真核的，“常用的内参基因是beta-actin，GADPH，rRNA基因等”，这句话在很多资料中出现。但是我的材料是细菌，是原核生物，用什么做为内参呢？按说GAPDH和rRNA基因都可以，是吧？但是，因为我的菌株是未知菌，我根本不知道它的GAPDH基因序列，所以无法自己设计引物，我想是不是这些常用内参的引物是通用的呢，结果我查到的是，不同物种的都不一样，所以好像我就不能用GADPH做内参了吧。好在我对它的16S rDNA已经进行了测序，得到了序列。请问我是否应该用16S做内参呢？
       问题二，如何进行引物设计呢？我指的是用什么软件好一些？我看到做定量对引物的要求很高。我需要设计两对引物，内参的和目的基因的。而且，两个基因的扩增片段大小应该基本差不多，是吧？200bp左右最好？
       问题三，标准曲线到底用什么做？我现在有几个概念比较混乱，实验组、对照组、标准品、内参、目的基因。标准曲线是要拿标准品扩增内参基因得到的吗？还是拿标准品扩增目的基因得到的？另外，我的实验中标准品是什么？
       问题四，我看到相对定量方法有两种：deltadelta Ct法和双标准曲线法，我用哪种好呢？deltadelta Ct法结果需要得到四个Ct值，好像这四个值是在一次定量PCR中得到的，是吗？也就是说，我对实验组和对照组都需要同时进行内参基因和目的基因的扩增？而双标准曲线法需要对内参基因和目的基因分别做标准曲线，是用对照组扩增两个基因得到吗？
  
在线等！求详解！多谢了……

[ Last edited by dhd997 on 2011-9-13 at 07:51 ]
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1楼 2011-09-12 16:18:31
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
★
西瓜(金币+1): 版主很热心啊 2011-09-13 11:57:07
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3499918
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真相是最大的奢侈品
2楼2011-09-13 08:27:16
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
学习一下，
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风雪夜归人
3楼2011-09-13 08:29:38
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梦想起飞

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wanhscn at 2011-09-13 08:27:16:
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3499918

多谢哈！！
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4楼2011-09-13 09:33:37
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wqj1988926

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 2011-09-13 18:13:44
第一.确定你的处理对你的16S没有影响，没有影响才能用作内参
第二 可以采用primer5设计引物，有破解版的，但只适用于32位操作系统
只会这两个，呵呵呵
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风雪夜归人
5楼2011-09-13 12:56:09
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梦想起飞

铜虫 (小有名气)
内容已删除
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6楼2011-09-14 10:53:56
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 居然漏评了，失职失职…… 2011-11-01 17:51:35
1.关于引物设计，现在常用的引物设计软件都可以。
2.关于定量方法：有相对定量和绝对定量两种，绝对定量需要做标准曲线，所以要用到标准品，所谓的标准品就是你要扩增的片段，并且要能确定它的拷贝数，因此标准品的制备是比较困难的；另一种就是相对定量，这种方法通过把参照Ct值调整到同一水平从而来校正两个样本的Ct值，然后对校正后的Ct值进行比较分析，根据你的描述做相对定量就可以了，所以没必要制备标准品。
3.关于内参，原则上只要能保证这个参照在不同样本中的稳定性就可以，具体选什么还是多查查资料
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梦想起飞
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
7楼2011-09-14 11:10:05
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梦想起飞

铜虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-09-14 11:10:05:
1.关于引物设计，现在常用的引物设计软件都可以。
2.关于定量方法：有相对定量和绝对定量两种，绝对定量需要做标准曲线，所以要用到标准品，所谓的标准品就是你要扩增的片段，并且要能确定它的拷贝数，因此标准品 ...

好的，学习了，谢谢哈！
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8楼2011-11-01 16:52:25
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tanaluck

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不太同意6楼的做法。最近的研究分析表明内参在处理和未处理的组织中表达情况是有变化的。所以不能保证拿来做内参可以起到参照的作用。所以有一种新的归一化方法是用到了绝对定量和相对定量的结合。这里提到了加入一段外源性的RNA来做标准曲线，之后进行相对定量分析。我觉得楼主的思路是对的。可能有点混乱。
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慢慢学，总会学到
9楼2012-03-14 14:22:27
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芦赞美

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
10楼2012-07-19 01:34:05
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