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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 放线菌分子生物学鉴定
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qwky2010

金虫 (著名写手)

[求助] 放线菌分子生物学鉴定

我提取的放线菌总DNA用通用引物扩增目的序列，测序结果如下：
您的PCR样品  (2)  （使用27F/1492R  引物  ）测序后发现有重叠现象,我们怀疑是由以下几个方面的原因造成的：
1.已纯化的PCR样品造成这种情况的原因是由于模板纯化有一定问题，模板中含有非特异性的条带；
2.如果是未纯化的PCR产物，那么有可能是您要求测序的片段周围含有大小相近的条带，我们通过琼脂糖凝胶回收，无法有效切除这种大小差别不是很明显的条带；
3.模板或是引物质量较差，测序反应结束之后没有产生足够的目的产物，导致测序信号较弱，杂背景较高，形成重叠现象。
    这些原因都可能造成PCR样品测序之后出现重叠现象.建议您改进后重新进行测序。
以上是测序公司的反馈，该怎么解决这些问题呢，谢谢大家。
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天道酬勤
1楼 2011-09-04 09:45:36
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qwky2010

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 瓶儿花 at 2011-09-04 10:19:54:
你有没有电泳检测PCR产物是否有杂带？如果有杂带的话你切胶回收，或是送给公司测序的时候说是未纯化的PCR产物。
另外，你可以做TA克隆，用pMD19-T Vector来做，效果很好，不会出现上述你说的重叠现象，但是必须保 ...

测序公司已经帮忙胶回收纯化了，但是无法有效切除这种大小差别不是很明显的条带，请问再怎么改进呢？
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天道酬勤
3楼2011-09-04 10:52:26
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

qwky2010(金币+5): 谢谢帮助 2011-09-04 11:01:30
你有没有电泳检测PCR产物是否有杂带？如果有杂带的话你切胶回收，或是送给公司测序的时候说是未纯化的PCR产物。
另外，你可以做TA克隆，用pMD19-T Vector来做，效果很好，不会出现上述你说的重叠现象，但是必须保证你回收的片段是纯的。
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2楼2011-09-04 10:19:54
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-09-04 17:48:10
这说明你PCR的非特异性扩增条带的大小跟你的目的基因条带的大小差不多，不易分离。你设置PCR反应程序的退火温度是多少？可以把退火温度提高一点，减少非特异性扩增。
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4楼2011-09-04 10:59:47
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-09-04 17:48:24
qwky2010(金币+15): 谢了啊 2011-09-05 16:59:39
个人建议还是做一下TA克隆比较好。不会出现重叠现象。
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5楼2011-09-04 11:01:06
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