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xjj5287

铁虫 (初入文坛)

[求助] 酶活性

自己用毕氏酵母表达的一个基因片段,通过培养,取样测出具有相关酶活性,但用FPLC 仪Purify后,酶活性消失了,请教这到底是哪出问题啦?
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

★ ★
西瓜(金币+2): Good 2011-08-19 18:36:23
你的FPLC纯化条件(包括层析柱、洗脱条件、预处理)破坏了酶的结构,先试一下别的层析柱或者别的纯化仪。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
3楼2011-08-19 17:52:03
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 欢迎交流 2011-08-19 18:36:13
是不是可以这么理解,你的酶粗提液有活性,纯化后没有活性了?
你表达的酶是否为真核生物的,如果是的话工程菌株中是否也有该酶的活性?
所以先确定你是否表达出你的酶了
2楼2011-08-19 16:39:12
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): very good 2011-08-20 09:44:00
1.如果是金属酶,纯化后没有了金属离子
2.酶活性本来就不高,纯化后被稀释了,所以测不到活性
3.纯化后浓缩了,但你的酶属于蛋白酶,自己把自己干掉了
4.你的酶不稳定,纯化后的缓冲液不合适,变性掉了
5.请确认你是否收获到了纯化后的酶
6.纯化温度太高,变性掉,这个还跟你的酶不稳定有关
7.仪器有滞后,收错管了
8.测活性的时候拿错收集管了
你说的太不详细了,我只能给你列一些可能是原因了
4楼2011-08-20 01:20:42
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doublehelix

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

LS说的在理!最大可能是你的酶不稳定,纯化后的缓冲液不合适,变性掉了
5楼2011-08-20 16:57:04
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