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04swlxy

银虫 (小有名气)

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[求助] 禽流感的分离方法

请各位指点一二：我从鸭场采集的病料分离禽流感病毒（临床疑似禽流感），第一次未分离到病毒，第二次我采集了肝脾心脏脑还是未分离到病毒。请问这是为什么呢？分离病毒的方法都有哪些呢？

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1楼2011-08-15 10:24:25

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天堂向左

金虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
rainwander(金币+4): 鼓励交流 2011-08-17 07:12:50
04swlxy(金币+10): 回帖很仔细，内容很有用 2011-10-21 19:55:07
zhang8826857(MicEPI+1): lz反馈很有用，奖励EPI一个^_^继续努力啊^_^ 2011-10-22 10:29:16

采集气管粘液或泄殖腔粘液，或病变组织（呼吸道、消化道），加纯水制作匀浆（10％悬液），低速冷冻离心机（台式或立式均可）3,000~4,000rpm, 4℃～5℃，15～20分，弃沉淀，即得到粗制的病毒液，可用负染法处理（用毛细管吸取悬液，滴在带有支持膜的铜网上，根据悬液内样品的浓度可立即或放置数分钟后，用滤纸从液珠边缘吸去多余液体，然后滴上负染液（常用重金属盐配置：如PTA（磷钨酸）、KPT（磷钨酸钾）、NaPT (磷钨酸钠)、醋酸钠、甲酸钠、钼酸铵等等）、染色时间1～2分钟，然后用滤纸吸去染液，待干燥后上透射电镜观测。如果粗制液中病毒成份极少，透射电镜观测不到，则可把悬液用离心浓缩仪浓缩；或用超速离心机，固定角式转头40,000rpm ×45 分钟，5℃取沉淀制成悬液上电镜观测。或用40,000rpm的甩平转头，30％～50％W/W 线性蔗糖梯度32,000rpm×50 分，5℃，病毒集聚在1.15～1.18g/cm3之间的某个位置形成纯样品区带；或用Ficoll,30％～40％W/W 线性梯度，病毒沉降在1.13～1.15g/cm3之间；或用Percoll作平衡等密度离心，自形成梯度，病毒悬液与Percoll混合，初始密度1.05g/cm3，用0.01M Tris-HCL作渗透平衡液，日立超速离心甩平转头P28S（上海天美肯公司购自）或SW28（贝克曼）转头，20,000rpm×30分钟，5℃。病毒在1.06 g/cm3附近形成纯样品区带。当然，也可以用溴化钠（钾）或碘化钠（钾）梯度进行禽流感病毒的纯化。