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保护你的大树

新虫 (小有名气)

[求助] 引物设计

各位大虾，我现在在设计一个名叫suv39h1基因的引物，最后连接到N1载体上面去，导师让我在设计引物的时候把下游的TAG终止密码子给去掉，所以下游的选择空间很小，只能紧挨着TAG前面设计下游引物，前面一次已经设计了一次，F ctcgagGGAAAGATGGCGGAAAAT  R cttaaggGAAGAGGTATTTGCGGCAG 但是可能是上下引物互补太厉害了（-5.3kcal/mol)上下引物tm值大概在62，如果调到67是否可以，现在我想是否可以先扩下TAG，然后在此基础上继续设计引物，这是下下策，我想问下除了这种方法还有什么好的方法。谢谢哈
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1楼 2011-07-31 16:22:33
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gwbk

木虫 (正式写手)
1，使用Tag酶PCR后做TA克隆，所有引物酶切位点都没有必要加保护碱基的，购买的T载体一般是开环的，PCR溶液回收后与T载体做连接。下一步可以从T载体中直接酶切得到你的带酶切位点的目的基因。
2，PCR后连其他载体，需要加保护碱基，操作步骤是酶切PCR产物和载体——切胶回收——产物和载体的连接——转化。保护碱基参考NEB保护碱基表。
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5楼2011-08-02 19:22:37
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): good 2011-08-01 08:20:40
保护你的大树(金币+10): 非常的感谢，我想再问问你用的软件是不是oligo5啊？还有为什么在F端得酶切位点上加TAT，在R端得酶切位点上加TAG,这几个碱基我看了下也不是什么保护碱基，而加他们的原因是什么呢？ 2011-08-01 16:59:22
保护你的大树(金币+10): 谢谢哈，我现在已经基本上懂了，只是想再问问，你先说XhoI是需要加引物的，而EcorI是可以不加引物的，这些都是在PCR后连在18T载体上的基础上还是在PCR后直接酶切连在目的载体的基础上？哪些酶切位点是必须加保护碱基的，哪些酶切位点是可以不加保护碱基的。 2011-08-02 08:57:11
1，楼主的酶切位点是Xho I/EcoR I，Xho I需要加保护碱基的，EcoR I加不加无所谓。
2，加完保护碱基后，3'端互补情况仍然没有得到解决，采用延长引物方法消除不了上下游引物的互补情况，加TAG也不能解决这个问题的。
3，可以减少R的3'端碱基数量，如：F TATctcgagGGAAAGATGGCGGAAAAT
R TAGcttaaggGAAGAGGTATTTGC（本设计仅供参考！）
4，特别强调的是，楼主可以通过减少3'端碱基数量重新设计这个引物（引物与模板互补序列不少于12bp就可以了）。
修改前

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2楼2011-07-31 23:59:42
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gwbk

木虫 (正式写手)
1，NEB给的保护碱基表现在也不怎么用了，加保护碱基不是严格按照那个表加的，可以根据引物GC含量调整保护碱基，推荐的保护碱基个数最好不变。
2，这是用oligo7得到的数据。
3，加上的那几个碱基是保护碱基的，我调整了一下，并不是按照NEB表格加的。
4，我设计引物的时候，如果加的碱基太多，保守起见，引物和模板重叠序列至少有15b，很少失败，12bp太极限，没试过。

oligo评估、引物设计如果有问题，可以回帖或者站内信通知我
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3楼2011-08-01 19:09:25
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保护你的大树

新虫 (小有名气)
谢谢哈，我现在已经懂了，谢谢你的帮助。
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4楼2011-08-02 08:52:20
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