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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): good 2011-08-01 08:20:40
保护你的大树(金币+10): 非常的感谢,我想再问问你用的软件是不是oligo5啊?还有为什么在F端得酶切位点上加TAT,在R端得酶切位点上加TAG,这几个碱基我看了下也不是什么保护碱基,而加他们的原因是什么呢? 2011-08-01 16:59:22
保护你的大树(金币+10): 谢谢哈,我现在已经基本上懂了,只是想再问问,你先说XhoI是需要加引物的,而EcorI是可以不加引物的,这些都是在PCR后连在18T载体上的基础上还是在PCR后直接酶切连在目的载体的基础上?哪些酶切位点是必须加保护碱基的,哪些酶切位点是可以不加保护碱基的。 2011-08-02 08:57:11
1,楼主的酶切位点是Xho I/EcoR I,Xho I需要加保护碱基的,EcoR I加不加无所谓。
2,加完保护碱基后,3'端互补情况仍然没有得到解决,采用延长引物方法消除不了上下游引物的互补情况,加TAG也不能解决这个问题的。
3,可以减少R的3'端碱基数量,如:F TATctcgagGGAAAGATGGCGGAAAAT
R TAGcttaaggGAAGAGGTATTTGC(本设计仅供参考!)
4,特别强调的是,楼主可以通过减少3'端碱基数量重新设计这个引物(引物与模板互补序列不少于12bp就可以了)。
修改前

修改后
2楼2011-07-31 23:59:42
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