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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 动物细胞蛋白提取含量低
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Illfxy

铜虫 (小有名气)

[求助] 动物细胞蛋白提取含量低

这两天提了两次蛋白但是含量都很低， 师兄过年那段时间提的有最高的有80ug/ml，可是这两天我用了同样的药品和方法 提出来只有20多，细胞密度挺高的不知为何。会不会与离心温度有关 ，我们实验室用冷冻离心机的人少，那台机子长期没人修，我也是才去，没办法就用了常温 。
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探索人类未来的其中一人
1楼 2011-07-24 19:56:38
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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
Illfxy(金币+3): 谢谢回复，谢谢你给出的方法，我会去试试的，buffer可能有问题，最近几天几个学弟提的量也很低 2011-07-26 10:22:11
lstt09nk(金币+5): 感谢交流 2011-07-26 10:34:29
lstt09nk(BioEPI+1): 2011-07-26 10:34:43
离心温度和转速对浓度的影响并不大，在这种实验中蛋白酶的杀伤作用并没有你想象中那么大，只在长期保存时才需要注意蛋白酶的抑制问题。

你师兄80ug/ml的提取浓度对于哺乳动物细胞而言是相当低的了，正常的话要1ug/ul左右，所以他的buffer本身可能就有问题，用这样的buffer你得到更低的效果也就可以理解了。建议你上网重新找一个标准的buffer配方，推荐你用RIPAbuffer，懒得配的话可以直接去santa cruz 公司买。或者更简单的方法是直接用SDS-PAGE 的上样buffer去裂解，超声再煮一下就好，核酸不多的话连离心都可以省了，缺点就是不能测蛋白浓度。
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摒气动方息，宁神心自明。
5楼2011-07-26 10:04:15
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Illfxy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by terry130 at 2011-07-26 10:04:15:
离心温度和转速对浓度的影响并不大，在这种实验中蛋白酶的杀伤作用并没有你想象中那么大，只在长期保存时才需要注意蛋白酶的抑制问题。

你师兄80ug/ml的提取浓度对于哺乳动物细胞而言是相当低的了，正常的话要 ...

刚接触动物细胞的实验，还以为那个蛋白含量是个正常值呢。谢谢你的回复，我换个buffer试试，那些方法我也会试试的。
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探索人类未来的其中一人
6楼2011-07-26 10:26:07
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子曰包子好吃

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

Illfxy(金币+2): 谢谢回复，你这一说，我觉得裂解液应该重新配一次来试试，还有那个离心温度会不会有很大影响 2011-07-25 11:51:49
你的裂解液中加了蛋白酶抑制剂了不？是不是浓度不够啊。还有提蛋白跟温度有很大关系，尽量在冰上操作，可以最大限度保证蛋白不被降解
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2楼2011-07-25 09:31:54
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Illfxy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 子曰包子好吃 at 2011-07-25 09:31:54:
你的裂解液中加了蛋白酶抑制剂了不？是不是浓度不够啊。还有提蛋白跟温度有很大关系，尽量在冰上操作，可以最大限度保证蛋白不被降解

裂解液是师兄之前4月配的，我也不清楚里面加了蛋白酶抑制剂了没，他说效果还好，就留着用了。我整个过程都尽量在冰上操作的，没有冷冻离心机，最后一步我用的是常温离心10min。室温很高开空调吹了两个小时还有27度，会不会是离心温度太高了？
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探索人类未来的其中一人
3楼2011-07-25 11:45:15
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子曰包子好吃

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-07-26 10:34:09
你最好确定一下是否加了蛋白酶抑制剂。如果没加，那蛋白浓度肯定高不了；如果加了，是什么时候加的，蛋白酶抑制剂最好是现用现加，而且他的有效时间一般在1-2个小时左右。最后一步室温离心问题不大。蛋白不是14000，20min吗？
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4楼2011-07-26 07:09:49
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Illfxy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 子曰包子好吃 at 2011-07-26 07:09:49:
你最好确定一下是否加了蛋白酶抑制剂。如果没加，那蛋白浓度肯定高不了；如果加了，是什么时候加的，蛋白酶抑制剂最好是现用现加，而且他的有效时间一般在1-2个小时左右。最后一步室温离心问题不大。蛋白不是1400 ...

恩，我会问问师兄的。蛋白离心我用的12000 10min这个影响应该不大吧
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探索人类未来的其中一人
7楼2011-07-26 10:29:04
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子曰包子好吃

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by Illfxy at 2011-07-26 10:29:04:
恩，我会问问师兄的。蛋白离心我用的12000 10min这个影响应该不大吧

尽量够20分钟吧!
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8楼2011-07-26 11:48:20
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Illfxy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 子曰包子好吃 at 2011-07-26 11:48:20:
尽量够20分钟吧!

谢谢 我会试试的
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探索人类未来的其中一人
9楼2011-07-26 12:16:46
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terry130

木虫 (正式写手)
离心的目的就是去除细胞碎片和核酸，一般都是满转离20-30min，这个不绝对，只要你的上清clear且不黏就可以了
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摒气动方息，宁神心自明。
10楼2011-07-27 07:59:23
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