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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 谁做过pEASY-Blunt Cloning啊？谁做过平末端连接啊？
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lingxingcao

新虫 (小有名气)

[求助] 谁做过pEASY-Blunt Cloning啊？谁做过平末端连接啊？

我用phusion酶PCR扩增出了我的产物，下一步是做连接，可是我不知道该怎么做。说明书看不懂啊？
克隆反应体系的建立
在微型离心管中依次加入溶液：
PCR 产物 0.5-4 μl
（根据PCR 产物量可适当增减，最多不超过4 μl）
pEASY- Blunt Cloning Vector 1 μl
轻轻混合，室温 (20℃-37℃) 反应5分钟。反应结束后，
将离心管置于冰上。
是这样做就可以了吗？怎么没加连接酶啊？
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1楼 2011-07-23 17:35:32
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changes

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good！ 2011-07-23 20:53:58
lingxingcao(金币+3): 谢谢 2011-07-25 10:53:49
不用连接酶的，他们公司的是利用拓扑异构酶的性质提供能量，反应体系里面什么都有了，加入插入片段和T载体后室温下反应5-10分钟就行了。然后就是转入感受态细胞了。
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2楼2011-07-23 20:28:53
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
lingxingcao(金币+2): 谢谢 2011-07-25 10:54:01
dhd997(金币+2): good 2011-07-25 12:35:57
引用回帖:
Originally posted by changes at 2011-07-23 20:28:53:
不用连接酶的，他们公司的是利用拓扑异构酶的性质提供能量，反应体系里面什么都有了，加入插入片段和T载体后室温下反应5-10分钟就行了。然后就是转入感受态细胞了。

注意要根据片段的亮度来适当调节加入的量，并非片段加的越多成功率越大，高浓度的片段会堵塞感受态细胞膜上的通道，不利于重组质粒的进入，还有就是由于受体细胞都有排他性，一旦有一条DNA进入，其余的就被排斥在外面了。
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
3楼2011-07-24 10:39:57
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lingxingcao

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by changes at 2011-07-23 20:28:53:
不用连接酶的，他们公司的是利用拓扑异构酶的性质提供能量，反应体系里面什么都有了，加入插入片段和T载体后室温下反应5-10分钟就行了。然后就是转入感受态细胞了。

phusion酶不太稳定吗？为什么我第一次扩出来了，相同的条件第二次就没扩出来呢?我的这个东西扩了好久了一直没扩出来，用ExTAQ酶扩了很久没出来，然后又用phusion酶扩。自己也找不到什么原因。请帮忙分析一下吧。
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4楼2011-07-25 11:01:27
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changes

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lingxingcao at 2011-07-25 11:01:27:
phusion酶不太稳定吗？为什么我第一次扩出来了，相同的条件第二次就没扩出来呢?我的这个东西扩了好久了一直没扩出来，用ExTAQ酶扩了很久没出来，然后又用phusion酶扩。自己也找不到什么原因。请帮忙分析一下吧。

你的模板材料(动物、植物、真菌、细菌还是质粒或文库，DNA、cDNA)、引物类型(普通、兼并、带酶切位点、修饰)、片段大小和模板的复杂程度？
另外第一次扩增产物和预测的产物大小相似吗？
以上都不了解，真的不好解释。
祝好运。
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5楼2011-07-25 19:01:23
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lingxingcao

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by changes at 2011-07-25 19:01:23:
你的模板材料(动物、植物、真菌、细菌还是质粒或文库，DNA、cDNA)、引物类型(普通、兼并、带酶切位点、修饰)、片段大小和模板的复杂程度？
另外第一次扩增产物和预测的产物大小相似吗？
以上都不了解，真的不 ...

谢谢
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6楼2011-07-26 09:25:34
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潘贤辉·

新虫 (初入文坛)
最近在做原核表达载体构建，我的目的片段大小为3.5kb和4.5kb，用的表达载体是全式金的pEASY-Blunt E2，感受态是E.coli DH5a，链接表达载体的体系是pcr产物3ul，ddH2O,1ul，pEASY-Blunt E2加1ul，总共5ul，室温30min，然后就转化感受态细胞加50ul，冰置30min，42℃热激90s，冰置2min，加250ulSOC，培养1h，涂板37℃培养，但是最后都没有长出菌落,平板上干干净净。这是这么回事啊？
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7楼2016-10-29 22:47:25
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3232mww

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 潘贤辉· at 2016-10-29 22:47:25
最近在做原核表达载体构建，我的目的片段大小为3.5kb和4.5kb，用的表达载体是全式金的pEASY-Blunt E2，感受态是E.coli DH5a，链接表达载体的体系是pcr产物3ul，ddH2O,1ul，pEASY-Blunt E2加1ul，总共5ul，室温30min ...

你的做出来了吗？我的做了几次，平板也是干干净净
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8楼2016-12-16 17:06:41
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