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lingxingcao

新虫 (小有名气)

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[求助] 谁做过pEASY-Blunt Cloning啊？谁做过平末端连接啊？

我用phusion酶PCR扩增出了我的产物，下一步是做连接，可是我不知道该怎么做。说明书看不懂啊？
克隆反应体系的建立
在微型离心管中依次加入溶液：
PCR 产物 0.5-4 μl
（根据PCR 产物量可适当增减，最多不超过4 μl）
pEASY- Blunt Cloning Vector 1 μl
轻轻混合，室温 (20℃-37℃) 反应5分钟。反应结束后，
将离心管置于冰上。
是这样做就可以了吗？怎么没加连接酶啊？

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1楼 2011-07-23 17:35:32

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潘贤辉·

新虫 (初入文坛)

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最近在做原核表达载体构建，我的目的片段大小为3.5kb和4.5kb，用的表达载体是全式金的pEASY-Blunt E2，感受态是E.coli DH5a，链接表达载体的体系是pcr产物3ul，ddH2O,1ul，pEASY-Blunt E2加1ul，总共5ul，室温30min，然后就转化感受态细胞加50ul，冰置30min，42℃热激90s，冰置2min，加250ulSOC，培养1h，涂板37℃培养，但是最后都没有长出菌落,平板上干干净净。这是这么回事啊？