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Primary and Secondary Binding Experiments. Radioligand binding assays using cloned GPCRs, ion channels, and transporters were performed using membranes from transiently transfected or stable cell lines as previously detailed(1, 46) through the resources of the National Institute of Mental Health Psychoactive Drug Screening Program. Detailed protocols (including cell handling, buffer composition, assay conditions, etc.) for all assays are available online.(https://pdsp.med.unc.edu/UNC-CH%20Protocol%20Book.pdf) Initial screening assays were performed using a 10-μM (final concentration)test compound, and the percent inhibition of specific binding by the test compound was determined. When the test compound inhibited >50% of radioligand specific binding, Ki determinations were performed by measuring the inhibition of radioligand binding by various concentrations of test drug (11 concentrations spanning six orders of magnitude). Radioligand binding isotherms were regressed using the One Site Competition Binding function built into Prism 4.0 (GraphPad) to estimate compound IC50 values. Affinity constants (Ki values) were calculated from IC50 values using the Cheng–Prusoff approximation. Representative Procedures. |
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木虫 (正式写手)
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- 虫号: 1012551
- 注册: 2010-05-06
- 专业: 有机合成
【答案】应助回帖
hzlx(金币+80, 博学EPI+1): 2011-07-21 23:35:19
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结合首要和次要实验方案，放射性配体结合使用克隆GPCRs检测法、离子通道和转运法用于短暂转染或稳定细胞系的细胞膜，详细参照(1,46)通过美国国家精神卫生研究院关于精神刺激药物筛选程序的资源。所有试验的详细协议（包括细胞处理,缓冲组成，测定条件等）可参照.(https://pdsp.med.unc.edu/UNC-CH%20Protocol%20Book.pdf) 首要筛选试验使用一个10-μM得测试化合物（末浓度），抑制百分比的特殊结合性通过测试化合物来决定，当测试化合物的抑制百分比>50%放射性配体时，通过各种浓度的测试药物（11浓度采用六个数量级）测量放射性配体的抑制百分比来决定Ki，放射性配体的等温线反复使用一个地址竞争结合作用建立棱镜4.0(GraphPad）来估算化合物IC50 的值，亲和常数（Ki值）可以通过Cheng–Prusoff 近似法得到的IC50值计算出来。 有代表性的程序。 |
2楼2011-07-21 22:44:42
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