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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 真核生物基因在大肠中表达 问题
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gaoqian8717

金虫 (小有名气)

[求助] 真核生物基因在大肠中表达 问题

大家好！前期做发酵优化，初入分子，有个疑问想请教下大家。
问题1：我做的是曲霉发酵产有机酸，在我的目的产物中有个关键基因a，如果我想把这个基因P出来后连接含强启动子的载体，然后转化大肠，是不是我设计引物时P出来的应该是基因a结构基因？
问题2：如果我另设计引物进行PCR时把基因a的原启动子和结构基因一起P出来了，连接含强启动子的载体后转化大肠，是不是这样基因a就不会表达？原因何在？

[ Last edited by gaoqian8717 on 2011-7-5 at 23:10 ]
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1楼 2011-07-05 22:52:48
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gaoqian8717

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-06 00:47:51:
我认为你还是别把原来的启动子弄出来，就用载体上的启动子，原因有2：
1、载体上的启动子是适合载体表达所用的，一般是诱导表达，表达可以控制，但是原启动子已经离开了原基因组，没有表达原件，也不知道是组成型 ...

谢谢你的回答，你说的很有道理，很专业。
我再详细描述下我的想法，实验中在低pH下（2.0）高产有机酸，高pH（4.5以上）基本不产。前人文献研究时发现低pH下该关键酶A活性明显高于后者。所以我推测基因a可能受低pH诱导调控，想设计实验方案验证下这一想法，前人也没做过。我是打算把结构基因P下来连接在载体强启动子的下游转化大肠；另外连同基因a的启动子一起P下来，连接在载体的多克隆位点中，受自己启动子的调控。
当然这样设计实验我知道是有很多问题的，比如：强启动子和自身带的启动子的强弱会影响基因的表达量；大肠在低pH下自己生存都困难，表达基因更不好说了。。。
可是我又没想出更好的思路来对这一推测（推测基因a可能受低pH诱导调控）进行验证，这个课题是新开课题，面临明年要发文章的问题，所以不太可能在曲霉里面做分子改造，质粒什么的都没有。难度太大，风险太大，首要的还是自己得先发文章，先毕业。
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3楼2011-07-06 09:04:52
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
wolfebst(金币+5, EPI+1): 鼓励 2011-07-06 08:49:14
我认为你还是别把原来的启动子弄出来，就用载体上的启动子，原因有2：
1、载体上的启动子是适合载体表达所用的，一般是诱导表达，表达可以控制，但是原启动子已经离开了原基因组，没有表达原件，也不知道是组成型还是诱导型的，表达控制条件不可知，可能对实验造成影响。
2、将原启动子弄出来之后可能会产生什么空间构象的影响，不利于表达。
3、原启动子存在时，如果使用载体上的启动子，增加的序列中可能会有ATG，那么转录出来的多肽会比预想中加长。

我觉得还是提取cDNA做RT-PCR好一点，因为真核生物和大肠杆菌的RNA剪辑可能不同，所以表达出来的蛋白质可能会移码，比预想的多几个氨基酸残基，可能不是你想要的蛋白质。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2011-07-06 00:47:51
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
引用回帖:
Originally posted by gaoqian8717 at 2011-07-06 09:04:52:
谢谢你的回答，你说的很有道理，很专业。
我再详细描述下我的想法，实验中在低pH下（2.0）高产有机酸，高pH（4.5以上）基本不产。前人文献研究时发现低pH下该关键酶A活性明显高于后者。所以我推测基因a可能受 ...

觉得你比较一个原核的启动子和p基因的启动子活性在大肠杆菌中的差异，(⊙o⊙)…  这是干什么呢，一个真核的启动子能在原核宿主中有活性么？？？
1.你倒是可以将曲霉里的组成型启动子（应该有不少已知的吧）和P基因的启动子在真核宿主（酿酒酵母或者毕赤酵母）中比较一下，当然启动子后面还是利用常规的报告基因LacZ吧，我不知道你如果后面是你的基因P的话，你容易检测么？如果容易检测的话，当然也好！
2.然后如果有差异的话，你可以在详细的研究一下启动子的各种元件了
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2011-07-06 20:53:28
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
楼主博士还是硕士，几年级，可以用来做实验的时间有几年？导师怎么想这个课题？这些都关系到课题设计的问题。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2011-07-06 21:14:20
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