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gaoqian8717金虫 (小有名气)
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真核生物基因在大肠中表达 问题
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大家好！前期做发酵优化，初入分子，有个疑问想请教下大家。 问题1：我做的是曲霉发酵产有机酸，在我的目的产物中有个关键基因a，如果我想把这个基因P出来后连接含强启动子的载体，然后转化大肠，是不是我设计引物时P出来的应该是基因a结构基因？ 问题2：如果我另设计引物进行PCR时把基因a的原启动子和结构基因一起P出来了，连接含强启动子的载体后转化大肠，是不是这样基因a就不会表达？原因何在？ [ Last edited by gaoqian8717 on 2011-7-5 at 23:10 ] |
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【答案】应助回帖
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wolfebst(金币+5, EPI+1): 鼓励 2011-07-06 08:49:14
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我认为你还是别把原来的启动子弄出来，就用载体上的启动子，原因有2： 1、载体上的启动子是适合载体表达所用的，一般是诱导表达，表达可以控制，但是原启动子已经离开了原基因组，没有表达原件，也不知道是组成型还是诱导型的，表达控制条件不可知，可能对实验造成影响。 2、将原启动子弄出来之后可能会产生什么空间构象的影响，不利于表达。 3、原启动子存在时，如果使用载体上的启动子，增加的序列中可能会有ATG，那么转录出来的多肽会比预想中加长。 我觉得还是提取cDNA做RT-PCR好一点，因为真核生物和大肠杆菌的RNA剪辑可能不同，所以表达出来的蛋白质可能会移码，比预想的多几个氨基酸残基，可能不是你想要的蛋白质。 |
2楼2011-07-06 00:47:51
gaoqian8717
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谢谢你的回答，你说的很有道理，很专业。 我再详细描述下我的想法，实验中在低pH下（2.0）高产有机酸，高pH（4.5以上）基本不产。前人文献研究时发现低pH下该关键酶A活性明显高于后者。所以我推测基因a可能受低pH诱导调控，想设计实验方案验证下这一想法，前人也没做过。我是打算把结构基因P下来连接在载体强启动子的下游转化大肠；另外连同基因a的启动子一起P下来，连接在载体的多克隆位点中，受自己启动子的调控。 当然这样设计实验我知道是有很多问题的，比如：强启动子和自身带的启动子的强弱会影响基因的表达量；大肠在低pH下自己生存都困难，表达基因更不好说了。。。 可是我又没想出更好的思路来对这一推测（推测基因a可能受低pH诱导调控）进行验证，这个课题是新开课题，面临明年要发文章的问题，所以不太可能在曲霉里面做分子改造，质粒什么的都没有。难度太大，风险太大，首要的还是自己得先发文章，先毕业。 |
3楼2011-07-06 09:04:52
fungixx
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