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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 候选基因功能验证
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佳木的复制品

金虫 (正式写手)

[求助] 候选基因功能验证

我通过用T-DNA激活标签（35S）插入突变获得抗旱相关突变体，最后确定了T-DNA附近的A、B、C、D四个候选基因，将这四个候选基因分别构建过表达载体，最后得到A、B、C、D四个候选基因的过表达转基因T0苗各30株。
我的目的是要验证这些候选基因哪个是真的跟抗旱相关，请问：
1）我应该用这些过表达的T0苗来做干旱试验？还是用T0繁种得到的T1，然后用过表达的T1来做干旱试验？还是用过表达的T2来做干旱试验？为什么？
2）如果用T0或T1苗来做验证？需要多少株苗？为什么？（比如我用了30株过表达基因A的T0苗做实验，结果有7株抗旱，23株不抗旱，那怎么去分析这个结果，这个基因A与抗旱相关的吗？如果结果是有23株抗旱，7株不抗旱或者是15株抗旱15株不抗旱，这个结果又该怎么分析呢？）
3）如果用过表达的T2来做实验，由于在T2已经分离了，所以T2植株会有过表达的纯合子和过表达的杂合子，用这个过表达的纯合子和过表达的杂合子做实验有什么区别？
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活着，是为了做点什么！
1楼 2011-06-20 14:47:34
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雨城雨

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

植物抗旱包含复杂的生理生化过程，涉及多个代谢途径及表达水平。在过表达基因的同时，加上RNAi，互补实验！T0苗一般比较弱，先繁殖T1种子，连续后代（到T2）进行严格的转基因验证（Southern、Northern或qRT-PCR, 或测酶活等），确定所转基因稳定遗传到后代中再抗旱鉴定！
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6楼2011-07-07 14:36:10
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ydniu

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

也想知道。帮助楼主顶一下
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2楼2011-06-21 16:25:18
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gwbk

木虫 (正式写手)
这个。。。还是比较复杂。帮你顶。
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3楼2011-06-21 20:28:22
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helloxiaobo

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+6, EPI+1): 很厉害！ 2011-06-23 14:43:58
佳木的复制品(金币+50): 非常感谢！！！ 2011-07-08 15:33:58
实验设计：
1 需要增加 互补验证的转化体 确定能够互补突变体表型，方能确定该基因为你要寻找的而目标基因。

2 关于实验数据的分析，首先建立抗旱的指标，不能简单的说是抗还是不抗，比如1级，2级，3级等。在T0代，将目标超标达各转化系（以及对照和突变体）
进行抗旱处理，采集各转化系的抗性等级，及其处理前后目标基因表达定量的数据。

3 当然条件许可用T1和T2来做则更好，可以进行三次重复

4 补充一点：超表达的各转化系有不同的抗性水平是正常的，只要按编号罗列上去就可以了。如有目标基因的表达数据与其匹配，则更加
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4楼2011-06-23 12:46:49
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