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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 紫外分光光度法测的吸光值怎么转化为酶反应初速度呢？
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Juliana芷蕊

金虫 (小有名气)

[求助] 紫外分光光度法测的吸光值怎么转化为酶反应初速度呢？

如题，我是用紫外光度法中的动力学测木素过氧化物酶（Lip）的酶活，
（测定方法：
取0.6 mL待测酶液，同时加入0.6 mL的10 mmol/L藜芦醇溶液，1.8 mL的酒石酸缓冲液（pH=3.0） 250 mmol/L，用0.03 mL，40 mmol/L的H2O2启动反应，总体积3.0 mL，25 ℃反应3 min，在310 nm（ε310=9300 mol-1cm-1）波长下测定吸光度的变化。同反应体系做空白样为不加入H2O2启动反应。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化藜芦醇产生1 μmol藜芦醛所需的酶量。）
问题是我测的曲线吸光度变化不大，而且各段的斜率不一，这样在计算酶活时选线性部分我就很困惑，不知道怎么选点比较好，平行样之间的平行性也不好，还有就是通过吸光度变化怎么转化成反应初速度呢？我做的是酶催化动力学，做动力学对条件要求是不是很苛刻呢？现在濒临崩溃，忠心希望各位师长能给些提点，小妹不胜感激。
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人生四项基本原则：懂得选择，学会放弃，耐得住寂寞，经得起诱惑。
1楼 2011-06-16 21:37:51
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swqowen

金虫 (职业作家)

勋章归天
其实我测的是淀粉酶的活性，还好有国标，但是好像发表的文章很少用国标测的，感觉误差还是很大的!平行试验误差控制在4%，基本不可能，还在困惑中！
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7楼2011-06-22 17:58:49
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zh1987hs

金虫 (著名写手)

分子模拟新手

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
wolfebst(金币+5, EPI+1): 鼓励一下 2011-06-16 23:13:45
Juliana芷蕊(金币+3): 我主要想问的是紫外分光光度法测的吸光值怎么转化为酶（Lip）反应初速度，主要想知道转化公式呢，还是谢谢你呢 2011-06-17 08:49:35
引用回帖:
Originally posted by Juliana芷蕊 at 2011-06-16 21:37:51:
如题，我是用紫外光度法中的动力学测木素过氧化物酶（Lip）的酶活，
（测定方法：
取0.6 mL待测酶液，同时加入0.6 mL的10 mmol/L藜芦醇溶液，1.8 mL的酒石酸缓冲液（pH=3.0） 250 mmol/L，用0.03 mL，40 mmol/ ...

你得先确认你的酶有没有活性
如果有活性的话，理论上是可以测定酶活的
1.动力学的测量数据好坏取决于你的底物浓度和酶的浓度，酶多了反应太快来不及检测。应该将酶液稀释，蛋白量可以用BRADFORD法测定，就我感觉600微升的酶液量挺大的了~
2.测量的线性范围至少应该是2min,结果才会比较可信。取得时候都是取初始的一段时间，要保证反应速率恒定
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2楼2011-06-16 23:01:05
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zh1987hs

金虫 (著名写手)

分子模拟新手

【答案】应助回帖

Juliana芷蕊(金币+3): 我主要是想将用紫外测的吸光度变化转化成酶反应初速度呢？前辈知道这方面的书籍吗？给推荐一下吧，不胜感激呢！有转化公式更好了，我做的是Lip酶呢 2011-06-17 16:33:43
引用回帖:
Originally posted by Juliana芷蕊 at 2011-06-16 21:37:51:
如题，我是用紫外光度法中的动力学测木素过氧化物酶（Lip）的酶活，
（测定方法：
取0.6 mL待测酶液，同时加入0.6 mL的10 mmol/L藜芦醇溶液，1.8 mL的酒石酸缓冲液（pH=3.0） 250 mmol/L，用0.03 mL，40 mmol/ ...

....这个问题很多书上都有的，基本来说，都是根据朗伯-比尔定律来计算的
I=εbc 其中I是吸光度，εbc 分别是：物质的吸光系数，光程，物质的量浓度，根据公式算出物质的量浓度变化，乘以反应体积，就是反应的物质的量，处于体系中的蛋白量，得到比酶活，做不同底物浓度下的比酶活，取双倒数，应该是接近线性的~再利用米氏方程的倒数形式求的Km就可以了
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3楼2011-06-17 09:02:41
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zh1987hs

金虫 (著名写手)

分子模拟新手

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
Juliana芷蕊(金币+44): 2011-06-17 22:42:22
amisking(金币-43): 楼主操作失误，申请取回多余金币。 2011-06-18 18:54:54
引用回帖:
Originally posted by zh1987hs at 2011-06-17 09:02:41:
....这个问题很多书上都有的，基本来说，都是根据朗伯-比尔定律来计算的
I=εbc 其中I是吸光度，εbc 分别是：物质的吸光系数，光程，物质的量浓度，根据公式算出物质的量浓度变化，乘以反应体积，就是反应的 ...

...俺说的就是怎么求啊~~~什么酶求都是类似的~主要就是从定义出发就可以了~书的话得弄本生物化学习题？呵呵~找找有没有酶活计算的~
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4楼2011-06-17 16:41:51
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