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Juliana芷蕊金虫 (小有名气)
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[求助]
紫外分光光度法测的吸光值怎么转化为酶反应初速度呢？
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如题，我是用紫外光度法中的动力学测木素过氧化物酶（Lip）的酶活， （测定方法： 取0.6 mL待测酶液，同时加入0.6 mL的10 mmol/L藜芦醇溶液，1.8 mL的酒石酸缓冲液（pH=3.0） 250 mmol/L，用0.03 mL，40 mmol/L的H2O2启动反应，总体积3.0 mL，25 ℃反应3 min，在310 nm（ε310=9300 mol-1cm-1）波长下测定吸光度的变化。同反应体系做空白样为不加入H2O2启动反应。一个酶活力单位（U）定义为每分钟氧化藜芦醇产生1 μmol藜芦醛所需的酶量。） 问题是我测的曲线吸光度变化不大，而且各段的斜率不一，这样在计算酶活时选线性部分我就很困惑，不知道怎么选点比较好，平行样之间的平行性也不好，还有就是通过吸光度变化怎么转化成反应初速度呢？我做的是酶催化动力学，做动力学对条件要求是不是很苛刻呢？现在濒临崩溃，忠心希望各位师长能给些提点，小妹不胜感激。 |
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Juliana芷蕊
金虫 (小有名气)
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- 注册: 2010-10-13
- 性别: MM
- 专业: 环境工程
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前辈们，我是只困惑的虫子，我也要算酶活，进而计算反应初速度，麻烦帮我下呢 我是用紫外分光光度计中的动力学测得木素过氧化物酶（Lip）酶在反应3min内的吸光度变化，变化大概有0.3左右，现在我很困惑，不知道怎么把吸光度变化转化成酶催化反应初速度呢。我测的过程：1cm比色皿中加 808ul 500mmol/l AOT/异辛烷储备液，1642ul异辛烷，30mmol/l溶在甲苯中的VA储备液+甲苯=250ul,60ul PH=3.6 的柠檬酸缓冲液，混合液振荡直至透明澄清。然后加入20ulLip酶液，轻轻混匀，20min后加入100ul溶在甲苯中的饱和H2O2溶液。于310nm处反应启动后立即记录吸光度A，吸光度A对反应时间t作图，初速度（umol•L-1•min-1）为A-t曲线线性部分的斜率。定义每分钟使1μmol的藜芦醇氧化成藜芦醛所需的酶量为一个酶活力单位(U)，藜芦醛的摩尔吸光系数9 300 mol-1cm-1。 我发了求助帖《紫外分光光度法测的吸光值怎么转化为酶反应初速度呢？》 麻烦前辈指点一二呢！谢谢呢…… |
5楼2011-06-17 19:31:52
【答案】应助回帖
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wolfebst(金币+5, EPI+1): 鼓励一下 2011-06-16 23:13:45
Juliana芷蕊(金币+3): 我主要想问的是紫外分光光度法测的吸光值怎么转化为酶（Lip）反应初速度，主要想知道转化公式呢，还是谢谢你呢 2011-06-17 08:49:35
wolfebst(金币+5, EPI+1): 鼓励一下 2011-06-16 23:13:45
Juliana芷蕊(金币+3): 我主要想问的是紫外分光光度法测的吸光值怎么转化为酶（Lip）反应初速度，主要想知道转化公式呢，还是谢谢你呢 2011-06-17 08:49:35
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你得先确认你的酶有没有活性 如果有活性的话，理论上是可以测定酶活的 1.动力学的测量数据好坏取决于你的底物浓度和酶的浓度，酶多了反应太快来不及检测。应该将酶液稀释，蛋白量可以用BRADFORD法测定，就我感觉600微升的酶液量挺大的了~ 2.测量的线性范围至少应该是2min,结果才会比较可信。取得时候都是取初始的一段时间，要保证反应速率恒定 |
2楼2011-06-16 23:01:05
3楼2011-06-17 09:02:41
4楼2011-06-17 16:41:51
