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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 亲和层析blue sepharose 6 Fast Flow 纯化羰基还原酶的问题
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炒饭大王

铜虫 (小有名气)

[求助] 亲和层析blue sepharose 6 Fast Flow 纯化羰基还原酶的问题

以20mM 6.5 磷酸盐缓冲液平衡，
样品上样后，平衡液淋洗，
以5mM NAD+（溶于20mM 6.5 磷酸盐缓冲液）洗脱，出现一个很巨大的峰，但是其中没有酶活，也就是没有结合目的蛋白，而上样淋洗液里有酶活。
现在的问题是为什么会不结合，目的蛋白是与辅酶一结合的，检测酶活也是利用辅酶一的减少来进行的。
是pH的问题？pH对亲和的影响大么，
是上样量的问题？
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1楼 2011-06-16 09:09:27
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炒饭大王

铜虫 (小有名气)
自己顶自己
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2楼2011-06-21 10:36:00
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

或许可以试试8.0的Tris缓冲。
另建议看看这个Dye ligand affinity systems文献。
很多染料亲和加入二价或三价金属离子可以帮助结合。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
3楼2011-06-21 11:08:57
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炒饭大王

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by snoopyzxx at 2011-06-21 11:08:57:
或许可以试试8.0的Tris缓冲。
另建议看看这个Dye ligand affinity systems文献。
很多染料亲和加入二价或三价金属离子可以帮助结合。

用了磷酸盐缓冲液8.0的，完全没有吸附，连杂蛋白也很少吸附
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4楼2011-06-21 22:13:21
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炒饭大王

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by snoopyzxx at 2011-06-21 11:08:57:
或许可以试试8.0的Tris缓冲。
另建议看看这个Dye ligand affinity systems文献。
很多染料亲和加入二价或三价金属离子可以帮助结合。

经试验，发现用NAD+洗脱的那个大峰，其实是辅酶一在280nm处的峰，不是蛋白峰。
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5楼2011-06-21 22:25:38
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
炒饭大王(金币+3): 谢谢你的资源 2011-06-22 13:46:48
lstt09nk(金币+2): 很热心 2011-06-22 17:10:19
文献见附件。
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VX：19192310212；公众号：生物技术与IVD
6楼2011-06-21 23:58:28
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