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炒饭大王

铜虫 (小有名气)

[求助] 亲和层析blue sepharose 6 Fast Flow 纯化羰基还原酶的问题

以20mM 6.5 磷酸盐缓冲液平衡,
样品上样后,平衡液淋洗,
以5mM NAD+(溶于20mM 6.5 磷酸盐缓冲液)洗脱,出现一个很巨大的峰,但是其中没有酶活,也就是没有结合目的蛋白,而上样淋洗液里有酶活。
现在的问题是为什么会不结合,目的蛋白是与辅酶一结合的,检测酶活也是利用辅酶一的减少来进行的。
是pH的问题?pH对亲和的影响大么,
是上样量的问题?
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炒饭大王

铜虫 (小有名气)

自己顶自己
2楼2011-06-21 10:36:00
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

或许可以试试8.0的Tris缓冲。
另建议看看这个Dye ligand affinity systems文献。
很多染料亲和加入二价或三价金属离子可以帮助结合。
VX:19192310212;公众号:生物技术与IVD
3楼2011-06-21 11:08:57
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炒饭大王

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by snoopyzxx at 2011-06-21 11:08:57:
或许可以试试8.0的Tris缓冲。
另建议看看这个Dye ligand affinity systems文献。
很多染料亲和加入二价或三价金属离子可以帮助结合。

用了磷酸盐缓冲液8.0的,完全没有吸附,连杂蛋白也很少吸附
4楼2011-06-21 22:13:21
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炒饭大王

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by snoopyzxx at 2011-06-21 11:08:57:
或许可以试试8.0的Tris缓冲。
另建议看看这个Dye ligand affinity systems文献。
很多染料亲和加入二价或三价金属离子可以帮助结合。

经试验,发现用NAD+洗脱的那个大峰,其实是辅酶一在280nm处的峰,不是蛋白峰。
5楼2011-06-21 22:25:38
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
炒饭大王(金币+3): 谢谢你的资源 2011-06-22 13:46:48
lstt09nk(金币+2): 很热心 2011-06-22 17:10:19
文献见附件。
VX:19192310212;公众号:生物技术与IVD
6楼2011-06-21 23:58:28
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