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lhwen182

金虫 (正式写手)

[求助] DGGE进样

请教各位高手，跑DGGE时是不是一定要将PCR产物浓缩到一定体积？我50微升体系P完后跑胶时经常会有一条贯穿整个胶面的横带，这个是不是进样量过大导致飘带引起的？
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1楼 2011-06-14 16:14:10
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caihy119

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3): 谢谢分享 2011-06-14 17:26:29
lhwen182(金币+2): 谢谢 2011-06-14 18:36:59
lhwen182(金币+2): 2011-06-15 20:20:59
反正我从来没有浓缩过, 跑得也挺好的. 我建议还是不要浓缩的好! PCR跑35个循环浓度已经很高了, 为什么还要浓缩呢?不过P后, 还是需要对产物纯化, 去掉引物二聚体还是很有必要的
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2楼2011-06-14 16:30:00
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小嫩瓜

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by caihy119 at 2011-06-14 16:30:00:
反正我从来没有浓缩过, 跑得也挺好的. 我建议还是不要浓缩的好! PCR跑35个循环浓度已经很高了, 为什么还要浓缩呢?不过P后, 还是需要对产物纯化, 去掉引物二聚体还是很有必要的

貌似是窜孔了吧，应该是样品跑出来了
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活的艰辛是因为执着和不放弃
3楼2011-06-14 17:26:41
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lhwen182

金虫 (正式写手)
★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-06-14 18:54:03
引用回帖:
Originally posted by caihy119 at 2011-06-14 16:30:00:
反正我从来没有浓缩过, 跑得也挺好的. 我建议还是不要浓缩的好! PCR跑35个循环浓度已经很高了, 为什么还要浓缩呢?不过P后, 还是需要对产物纯化, 去掉引物二聚体还是很有必要的

你的纯化是怎么做的啊？好像我问的几个老师都没怎么做纯化，他只是将产物真空浓缩后就跑了。再说引物二聚体不是很小么，跑胶时不是会跑出去的么？
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4楼2011-06-14 18:36:04
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caihy119

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

lhwen182(金币+4): 2011-07-11 21:42:14
错了, 一般DGGE的条带长度400 bp左右, 而primer-dimer长度也可以达到100 bp左右, 如果你的DGGE梯度和电泳的时间不是足够, primer-dimer是还在胶里面的, 而且一般做实验为了保险起见, 一般是不会跑得太久的, 很有可能在最底部就是primer-dimer. 我的建议一定要纯化, 这样就保证你的DGGE没有问题. 现在有很多的纯化试剂盒可用，生工的， takara的， 都很好用的， 如果你有真空浓缩系统， 也可以用PEG8000沉淀后，离心浓缩，干燥也可以把primer-dimer去掉，而且可以浓缩你的PCR产物
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5楼2011-06-16 09:23:36
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lhwen182

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by caihy119 at 2011-06-16 09:23:36:
错了, 一般DGGE的条带长度400 bp左右, 而primer-dimer长度也可以达到100 bp左右, 如果你的DGGE梯度和电泳的时间不是足够, primer-dimer是还在胶里面的, 而且一般做实验为了保险起见, 一般是不会跑得太久的, 很有可 ...

恩，谢谢你的建议。我再优化一下再做做看
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6楼2011-06-17 15:18:56
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