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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 综合其他 » NADPH活性的测定
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putongpy

禁虫 (正式写手)
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1楼 2011-06-08 14:06:48
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额敏的雪

金虫 (著名写手)
★ ★
SongQ5285: 金币+2, 你重新开一贴，可能会有人帮你解答 2012-06-21 08:17:01
已经测过一次NADPH氧化酶的活性，但是数值没有变化，不知道是哪里出现了问题。实验的时候没有找到具体的操作步骤，只是找了N 篇文献综合总结了一下，想的实践出真知，就大胆的做了，结果失败了。哪位仁兄测过，指点一二。  我参照的实验方法：
    由NADPH氧化酶生成的活性氧产物被检测到，在25度下，SOD抑制的，NADPH依赖的在550nm下细胞色素C的减少。像Heyworth et al （1993）描述那样，反应混合液包括0.1mM的细胞色素C，6.5mMMgCL,87Mmkcl,2.6mMNaCL,8.7mMPipes,Ph 7.3,10pM GTP(y)S,0.16Mmnadph,he10-15pg质膜蛋白，总体积1ml。对照试验包括50pg的SOD来说明在没有活性氧依赖的细胞色素的减少。DPI（at 5 pM），质膜NADPH氧化酶的一种酶激活不可逆抑制剂，抑制激发子激发的NADPH氧化酶的活性。

我遇到的问题：
膜蛋白是高速离心后提取的，应该没有什么问题。测定时加的是150微克。
我遇到的问题是：1，加入SOD和不加sod的对照和处理，及重复之间的吸光值都在0.200-0.215之间，数值之间没有差异。

2，虽然现在实验还没有做出来，但是希望您能把计算的公式也给我一份。
因为我没有找到详细的实验步骤。实验准备的时候我综合了好几个实验版本。下面是我的操作步骤，以便你帮助我找到我错误的地方：1 先加膜蛋白
       2 （将所用的试剂配成混合液，有两份，一份加了SOD,一份没有）加入反应混合液。
       3 加入NADPH启动反应，5min后测定其吸光值。
  我一个处理做了6管，3管加的是有SOD的混合液，另外3管加的是没有SOD的混合液。
其实我也试过加入NADPH后立即测其5min的吸光值，但是在5min的反应过程中，吸光值根本没有变化。加入浓度的NADPH时吸光值有微小的变化。
我也想知道怎么做，求助，交流
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7楼2012-05-25 09:54:52
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cmzcbPH

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
jhu132llh(金币+3): good,鼓励积极交流 2011-06-13 19:18:02
putongpy(金币+10): 谢谢了。。 2011-06-14 07:56:43
以前实验室有师兄做过NADH含量的测定，不知道你这是不是一样，估计原理应该是一样的。

根据NADH特异的A340的吸收峰，制作标准曲线，然后据此测定样品中的含量。
如果想测定相关酶的活性，就在反应系统中定量加入改酶反应，根据NADH的变化量来确定酶活。

希望能够有帮助。
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2楼2011-06-13 08:24:19
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putongpy

禁虫 (正式写手)
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3楼2011-06-14 07:57:20
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HarveyWang

捐助贵宾 (知名作家)

海外行者
★
jhu132llh(金币+1): good 2011-06-27 15:33:21
NADPH/NADH的测定需要购买试剂盒。你可以自己google
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【我一直认为做土匪很性感很坏，很直接，可以大声喊：JCMM我爱你！所以，我自从博士毕业后，就一直在寻找黑道大哥一起去抢钱、抢粮、抢地盘】
4楼2011-06-27 13:47:38
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