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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助Western-bot转膜问题
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blueghost006

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助Western-bot转膜问题

各位大虾，
    小子我初学做Western-blot,做了三次，每次转膜后发现PVDF膜上没有一点MARK痕迹，（转膜前胶上MARK条带非常清楚），我用的是湿转法，100V，45分钟，目标蛋白为41KD，当然接下来的结果就是膜上什么都没有，一片空白，这是怎么回事呀？小子我都快崩溃了，敬请各位大虾指点迷津~~~~
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1楼 2011-06-02 21:22:49
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blueghost006

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by muzihai at 2011-06-04 09:22:51:
我之前做转膜，分子量60左右，一般130ma转1.5小时，另外你可以把胶染色看看是不是没转过去或者放反了。仔细检查一下，总之任何错误都会导致实验失败。

我昨晚又仔细重做了一次，转膜1小时，发现转膜成功了，我染那个胶发现上面还是有蛋白痕迹，下次会进一步摸索最佳转膜时间，呵呵，谢谢你的提醒，我发现我是比较粗心，以后会更仔细的做~~~~
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12楼2011-06-04 11:34:56
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ET生物人

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-06-03 09:49:31
可能mark和目的蛋白被转移出去了！！你尝试降低电压到90V或减短转移的时间！！
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3楼2011-06-03 09:48:55
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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): Good! 2011-06-03 18:30:18
跟楼上观点相反，100v没问题，45分钟只能说短，绝对不算长。marker在这个条件下应该会转过去的。感觉LZ的问题不再这里。看看你的buffer是否正确，如果别人用没问题的话就不是buffer的问题。另外一个容易忽视的事情是在转膜前你的pvdf膜要先用甲醇浸泡几分钟再放到buffer中做夹心。没有甲醇活化的话就会出现你这种情况，不只是marker你的蛋白也转不上去。LZ是不是没有活化？？？
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摒气动方息，宁神心自明。
4楼2011-06-03 16:24:55
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blueghost006

新虫 (初入文坛)
我活化了哦~~~~~转膜试剂体系都是严格按照师兄他们的体系配制的哦~~我这次加大转膜时间，用一小时试试~~~
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5楼2011-06-03 18:00:09
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