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墨池

银虫 (小有名气)

[求助] 大家评论下这个不伦不类的银染方法

银染法分为强碱法和弱碱法，我用师姐之前做过的方法，具体描述如下，大家评论下这个不伦不类的方法（既非强碱法亦非弱碱法啊，伤不起呀）

    电泳后采用银染的方法，银染[12]主要步骤：(1)去离子水洗脱3min；(2)10%乙酸固定10min；(3)去离子水洗脱2min；(4)银染15min(0.1%AgNO3)；(5)去离子水洗脱0.5min；(6)显影液脱色6min（16gNaOH， 8ml37%甲醛溶液，用ddH2O定溶至1L）；(7)10%乙酸固定1min；(8)去离子水洗脱，最后用相机或是在凝胶成像系统中拍照。

PS：顺便问下，甲醛的作用是什么？一般要加多少量？还有，弱碱法底色是浅，但会不会造成条带分辨率不是很好呢？

  小女子这厢谢过大家(*^__^*) 嘻嘻
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1楼 2011-06-02 15:14:06
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maizecotton

金虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励经验交流 2011-06-03 13:37:02
引用回帖:
Originally posted by 墨池 at 2011-06-02 15:14:06:
银染法分为强碱法和弱碱法，我用师姐之前做过的方法，具体描述如下，大家评论下这个不伦不类的方法（既非强碱法亦非弱碱法啊，伤不起呀）

    电泳后采用银染的方法，银染[12]主要步骤：(1)去离子水洗脱3min； ...

好复杂呀。我们就有两步，第一步渗透，第二步染，就这么简单。
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2楼2011-06-03 12:45:15
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 欢迎应助。能否顺便回答下楼主顺便问的问题呢，嘿嘿 2011-06-03 18:31:39
墨池(金币+1): 2011-06-03 20:32:37
1.        固定液（乙醇 50 mL，冰醋酸2.5 mL）固定15 min
2.        Milli-Q纯水清洗，20 s和2 min各一次
3.        银染液（硝酸银1 g，37%甲醛0.75 mL）染色15 min
4.        Milli-Q纯水清洗，20 s和2 min各一次
5.        显色液（氢氧化钠7.5 g，37%甲醛2.5 mL）显色5-7 min
6.        最后用终止液（乙醇50 mL，冰醋酸2.5 mL）终止反应
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3楼2011-06-03 13:58:22
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

墨池(金币+1): 2011-06-03 20:32:32
引用回帖:
Originally posted by xiadongliang at 2011-06-03 13:58:22:
1.        固定液（乙醇 50 mL，冰醋酸2.5 mL）固定15 min
2.        Milli-Q纯水清洗，20 s和2 min各一次
3.        银染液（硝酸银1 g，37%甲醛0.75 mL）染色15 min
4.        Milli-Q纯水清洗，20 s和2 min各一次
5.        显色液（氢氧化钠7 ...

1.        用固定液（乙醇 50 mL，冰醋酸2.5 mL，定容500 mL）固定15 min
2.        Milli-Q纯水清洗，20 s和2 min各一次
3.        银染液（硝酸银1 g，37%甲醛0.75 mL，定容500 mL）染色15 min
4.        Milli-Q纯水清洗，20 s和2 min各一次
5.        显色液（氢氧化钠7.5 g，37%甲醛2.5 mL，定容500 mL）显色5-7 min
6.        最后用终止液（乙醇50 mL，冰醋酸2.5 mL，定容500 mL）终止反应
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4楼2011-06-03 13:59:38
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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): Good！ 2011-06-03 18:36:30
墨池(金币+1): 2011-06-03 20:32:27
下面是我们实验室用的印染protocol，很好用，给你做参考

Fresh Solutions：

0.02%  Sodium Thiosulfate (Na2S2O3)
0.1% AgNO3 for minigel and 0.15% for large gel. Stored in 4ºC before use.
2% Na2CO3 + 0.04% formaldehide. Prepare fresh.

Note: Wear clean gloves when handling all materials. Take special care to touch only the same corner of the gel to prevent staining artifact. Clean glasses very carefuly when preparing the gel. Place gel in clean glass container before staining

Staining steps  (for minigels). Every step needs gently shaking.

Fixation: 200ml 50% methanol + 5% acetic acid for 20min or ON (1 hour for large gels).
Rinse 1: 200ml 50% methanol for 10min  (20min for large gels).
Rinse 2: 200ml H2O for 10min (15min for large gels).
Sensitization: 200ml 0.02% Na2S2O3 1min.
Rinse:H2O 2 x 1min.
Stain: 200ml chilled 0.1% AgNO3 for minigel (0.15% for large gel) for 20min. Keep from light.
Rinse: H2O 2 x 1min.
Develop: 2% Na2CO3 + 0.04% formaldehide with intensive shaking. After 20-30 seconds (solution turns yellow), replace it with new develop solution. Develop to the degree you want. You can change develop solution again after 2-3minutes.
Stop: 5% acetic acid 2 x 3min.
Store: 1% acetic acid at 4ºC, or rinse gel with same solution and then with H2O. If you need material for Mass Spectrometry cut the bands and store in 1.5ml plastic tubes at 4ºC.
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摒气动方息，宁神心自明。
5楼2011-06-03 16:21:15
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