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zqh2912

新虫 (初入文坛)

[求助] 噬菌体淘选之后做ELISA没结果的问题

我现在做的是用噬菌体展示技术直接淘选硫酸软骨素,以期得到与硫酸软骨素的结合肽以作进一步的实验。现在一共进行了5轮淘选(一般而言,3轮就够了)从洗脱物的滴度来看,有富集表现,但是也不算明显(1此方,2此方,2此方,3此方)。不过每轮扩增后的滴度都能在10的11此方级别。现在的问题是,用这样的淘选物去做ELISA,与对照相比没有结果。其中:1,硫酸软骨素是一个黏多糖,不太好包被,但是也有文献说明可以包被上去。2,做ELISA时都有阳性对照,所以可以排除手法问题。而我的问题是:1,为什么都是包被相同的分子,洗脱液及封阻液都相同,但是经淘选得出的洗脱物却不能通过ELISA检验?2,如果淘选出的是非特异性的,那么这些Phage是和什么结合了,是BSA封阻液还是就是96微孔板?3,如何解决现在的问题?谢谢各位大虾指导哈~
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zqh2912

新虫 (初入文坛)

谢谢!但是我也是这么想的,所以严格了条件,然后在严格条件之下得到的便被理解为了特异性的(因为我想非特异性的无法通过更严格的条件),但是现在师姐的意思是,无论严格与非严格,事实上都会有phage留下,而严格的后果是可能将潜在的特异性phage去除,产生假阳性结果。而我后面又做了一次未包被靶分子的空白对照,确实仍然有phage留下,但是比例为正常组百分之一,当然经过扩增后其滴度会极大的提高,但是仍然有矛盾之处。另外,请问如何提高特异性的?
5楼2011-06-17 10:32:52
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limichuan

金虫 (正式写手)

免疫学实验超人qq:858200882

【答案】应助回帖

zqh2912(金币+5): 要是能再多些帮助就好了,但是还是谢谢,毕竟是第一次发帖~ 2011-06-10 20:12:44
傻傻的问句,楼主是用间接法做的吗,
本公司专业从事蛋白纯化,抗体制备等免疫实验技术服务。欢迎咨询qq:858200882
2楼2011-06-01 03:21:04
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zqh2912

新虫 (初入文坛)

弱弱的回答下:淘选和ELISA都是用的直接法哈。用的是NEB的噬菌体库,在最后一步的时候我严格了淘选条件,之前一直以为是不够严格所以没有淘到特异性的Phage,昨天和师姐讨论了下, 她说有可能是太严格了导致特异性的都没留下来,而一直洗脱,扩增的都是非特异的。请问有这样的可能吗?
3楼2011-06-02 09:18:04
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limichuan

金虫 (正式写手)

免疫学实验超人qq:858200882

有的,如果你特异性的少那么同样的扩增实际上就等于稀释了。你可以想办法增加特异性比例再扩增。
本公司专业从事蛋白纯化,抗体制备等免疫实验技术服务。欢迎咨询qq:858200882
4楼2011-06-11 13:39:00
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