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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 网络生活区 » 有奖问答 » 实验讨论 » 噬菌体淘选之后做ELISA没结果的问题
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zqh2912

新虫 (初入文坛)

[求助] 噬菌体淘选之后做ELISA没结果的问题

我现在做的是用噬菌体展示技术直接淘选硫酸软骨素，以期得到与硫酸软骨素的结合肽以作进一步的实验。现在一共进行了5轮淘选（一般而言，3轮就够了）从洗脱物的滴度来看，有富集表现，但是也不算明显（1此方，2此方，2此方，3此方）。不过每轮扩增后的滴度都能在10的11此方级别。现在的问题是，用这样的淘选物去做ELISA，与对照相比没有结果。其中：1，硫酸软骨素是一个黏多糖，不太好包被，但是也有文献说明可以包被上去。2，做ELISA时都有阳性对照，所以可以排除手法问题。而我的问题是：1，为什么都是包被相同的分子，洗脱液及封阻液都相同，但是经淘选得出的洗脱物却不能通过ELISA检验？2,如果淘选出的是非特异性的，那么这些Phage是和什么结合了，是BSA封阻液还是就是96微孔板？3，如何解决现在的问题？谢谢各位大虾指导哈~
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1楼 2011-05-31 16:40:19
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limichuan

金虫 (正式写手)

免疫学实验超人qq：858200882

【答案】应助回帖

zqh2912(金币+5): 要是能再多些帮助就好了，但是还是谢谢，毕竟是第一次发帖~ 2011-06-10 20:12:44
傻傻的问句，楼主是用间接法做的吗，
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本公司专业从事蛋白纯化，抗体制备等免疫实验技术服务。欢迎咨询qq：858200882
2楼2011-06-01 03:21:04
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zqh2912

新虫 (初入文坛)
弱弱的回答下：淘选和ELISA都是用的直接法哈。用的是NEB的噬菌体库，在最后一步的时候我严格了淘选条件，之前一直以为是不够严格所以没有淘到特异性的Phage，昨天和师姐讨论了下， 她说有可能是太严格了导致特异性的都没留下来，而一直洗脱，扩增的都是非特异的。请问有这样的可能吗？
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3楼2011-06-02 09:18:04
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limichuan

金虫 (正式写手)

免疫学实验超人qq：858200882
有的，如果你特异性的少那么同样的扩增实际上就等于稀释了。你可以想办法增加特异性比例再扩增。
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4楼2011-06-11 13:39:00
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zqh2912

新虫 (初入文坛)
谢谢！但是我也是这么想的，所以严格了条件，然后在严格条件之下得到的便被理解为了特异性的（因为我想非特异性的无法通过更严格的条件），但是现在师姐的意思是，无论严格与非严格，事实上都会有phage留下，而严格的后果是可能将潜在的特异性phage去除，产生假阳性结果。而我后面又做了一次未包被靶分子的空白对照，确实仍然有phage留下，但是比例为正常组百分之一，当然经过扩增后其滴度会极大的提高，但是仍然有矛盾之处。另外，请问如何提高特异性的？
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5楼2011-06-17 10:32:52
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moyixq

铜虫 (小有名气)
用什么洗脱的是gly hcl还是特异洗脱
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要和相投的人做实验才会高兴
6楼2012-06-01 14:53:10
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顺水飘扬

新虫 (初入文坛)
遇到同样的问题，楼主找到解决方案了么
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7楼2015-12-23 15:37:05
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