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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白表达上清可溶部分很少，有必要做包涵体复性吗？
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1楼2011-05-28 15:18:08
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-05-28 22:09:59
wickhamhan(金币+3): 谢谢回帖 2011-05-29 14:43:41
可以做一个不同温度下，不同IPTG诱导下，看看表达量怎么样？
如果已经确定是包涵体的话就不太好办了。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-05-28 15:38:54
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
amisking(金币+4): 鼓励应助 2011-05-28 22:09:55
wickhamhan(金币+4): 谢谢回帖 2011-05-29 14:43:48
如果16度诱导还是可溶性表达少的话，基本上没有优化温度和IPTG浓度的必要了。

不同蛋白结晶浓度差异很大，有的只要2mg/ml，有的需要将近100mg/ml。你可以查一下同源性最高的蛋白的结晶浓度。如果需要很高浓度的话，复性基本上不可行，得率很低。如果很低的话，复性可以一试。

可以试试不同的载体，看看能否促进可溶性表达，例如从His载体换到GST载体。不知道你的基因中是否有稀有密码子，如果有的话，可以换到Rosetta 2等宿主中试试。

是在不行就只有筛克隆了，做不同的Truncation。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2011-05-28 18:47:03
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★ ★
dhd997(金币+4): good 2011-05-29 09:34:02
诱导时间梯度有没有做过？不是别人说诱导过夜就过夜的，白天做一次吧，做个时间梯度。还有稀有密码子我也怀疑是个问题，用BL21的DE3不好就换Rosetta。最后要说的是如果蛋白质太稀了就浓缩一下，超滤或者上层析柱一次都行，只要蛋白质够多就能玩。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜素论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2011-05-29 00:56:47
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deblway

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6): 很活跃喽 2011-05-30 12:47:46
wickhamhan(金币+3): 受用 2011-05-30 15:18:23
如果包涵体较多的话，是会很麻烦的！就跟楼主说的一样复性过程需要蛋白有一个正确折叠，这需要对复性条件进行控制，单单是这个工作量就可想而知了。。但是貌似原核表达蛋白即使可溶达到完全的正确构象也比较难吧。。。。总之，如果低温等条件都试过了的话，估计就需要换宿主菌咯。。楼上几位大大说的rosetta菌确实不错，可以一试，更重要的是如果想大量可溶的话最好还是换一个标签进行融合表达，有很多分子伴侣类标签是可以在表达过程中辅助蛋白正确折叠的如小泛素类蛋白，这方面的标签还挺多的，正确折叠了包涵体就可能少了很多。。当然也不是万能的，目的蛋白中如果二硫键较多的话也不好办，总之能拿到纯度高且够用的蛋白就OK了。。。。
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海贼王！哥当定了。。。。
5楼2011-05-30 11:54:38
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疯花血月

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-05-29 00:56:47:
诱导时间梯度有没有做过？不是别人说诱导过夜就过夜的，白天做一次吧，做个时间梯度。还有稀有密码子我也怀疑是个问题，用BL21的DE3不好就换Rosetta。最后要说的是如果蛋白质太稀了就浓缩一下，超滤或者上层析柱一 ...

对于诱导时间，我有个疑问。即使取了不同的时间点，但是随着培养时间的延长，可溶性蛋白应该会达到一个浓度吧。过夜后，应该是有就是有，没有就是没有了。我觉得最后一个可以尝试的方法就是降低转速了，90rpm试试吧
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6楼2011-07-30 15:02:43
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
西瓜(金币+1): 鼓励 2011-07-30 23:34:46
引用回帖:
Originally posted by 疯花血月 at 2011-07-30 15:02:43:
对于诱导时间，我有个疑问。即使取了不同的时间点，但是随着培养时间的延长，可溶性蛋白应该会达到一个浓度吧。过夜后，应该是有就是有，没有就是没有了。我觉得最后一个可以尝试的方法就是降低转速了，90rpm试 ...

诱导一般都是用低转速的
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7楼2011-07-30 17:57:20
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929519755

金虫 (正式写手)
你先可以看看这个蛋白好不好纯化,如果很好纯化的话,可溶性表达量低也没有关系.
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想你没话说
8楼2013-08-12 13:49:40
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落满夏天

银虫 (正式写手)
主要是看结构，二硫键有几对？单链还是双链？疏水性如何？包涵体复性现在也挺成熟的，方法对了不难复性。品种差异吧。
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星星之火，可以燎原
9楼2013-10-14 12:21:33
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ljj0720

银虫 (正式写手)
楼主后来是怎么解决的呢？
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10楼2014-04-13 21:14:22
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