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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 药学 » 生物制药 » Ni柱分离纯化6His标签重组蛋白
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老实人sdu3375

木虫 (正式写手)

[求助] Ni柱分离纯化6His标签重组蛋白

本人用镍柱分离带有6个组氨酸标签的重组蛋白，缓冲液是20mM磷酸三钠、500mM氯化钠、10mM咪唑，洗脱缓冲液是250mM咪唑。经过几次层析后发现：我的目的蛋白都穿透了，没有挂住。。。请问大家，这是怎么回事呢？该咋办呢？谢谢！
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1楼2011-05-06 16:24:24
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待工作如初恋

新虫 (初入文坛)
目的蛋白在PH7.4下不稳定，可以在PH7.3-8.3的范围内对缓冲液的PH调整；200mM咪睉未洗脱下目的蛋白质，可以继续提高咪睉浓度；洗杂蛋白时候目的蛋白液洗脱，洗杂缓冲液中咪睉浓度降低或者不添加；一些情况下，缓冲液中添加5%-10%的甘油，0.1%的tween,0.5M的NACl会提高蛋白质纯化的效果。
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16楼2015-03-10 13:15:03
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秋叶漫漫

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
karl2100(金币+1): 谢谢！ 2011-05-09 19:05:52
老实人sdu3375(金币+2): 2011-05-12 10:17:32
我没理解你的穿透是哪种意思，呵呵
1，如果是250mM咪唑的洗脱液将你的蛋白洗脱下来的，这是正常的，250的咪唑就是为了洗脱蛋白
2，在10mM的情况下，蛋白就下来了，如果你的测序是正确的，那可能是蛋白的立体结构使His标签没有完全暴露在外，与Ni结合不紧密。
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一只小笨鸟，飞呀飞呀飞~
2楼2011-05-09 01:02:56
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老实人sdu3375

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 秋叶漫漫 at 2011-05-09 01:02:56:
我没理解你的穿透是哪种意思，呵呵
1，如果是250mM咪唑的洗脱液将你的蛋白洗脱下来的，这是正常的，250的咪唑就是为了洗脱蛋白
2，在10mM的情况下，蛋白就下来了，如果你的测序是正确的，那可能是蛋白的立体结构 ...

嗯，您说的这种情况很可能发生。那是不是也有可能和填料有关呢？
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3楼2011-05-09 09:10:05
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秋叶漫漫

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

老实人sdu3375(金币+3): 2011-05-12 10:17:39
引用回帖:
Originally posted by 老实人sdu3375 at 2011-05-09 09:10:05:
嗯，您说的这种情况很可能发生。那是不是也有可能和填料有关呢？

可能与Ni柱的载样量有关系，只能挂住一定量的蛋白，剩下的都透过去了。
你们实验室还有人用Ni柱吗？问问他们载样量多大吧。
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一只小笨鸟，飞呀飞呀飞~
4楼2011-05-09 16:31:10
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