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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】分子克隆
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djrhewc

银虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
Originally posted by fhh819 at 2011-04-16 21:27:45:
请教高手：1、为什么我在蓝白斑筛选的时候，板子上全是白斑，没有篮班，但是菌液pcr检测的时候，跳了120多个菌，才有2个p出目的条带！
                  2、为什么我的板子上白斑少，并且都在靠近培养皿的边上， ...

另外，请问楼主，我挑了100个白斑，菌落pcr之后大约只有3,4个有目的条带，质粒，感受态细胞，切胶试剂盒全都换过，还是不能解决这个很简单的实验，快被老师逼疯了...刚做了一个对照,空载体转入感受态细胞,长的斑也大部分为阳性,可能X-gal失效?准备不用蓝白斑直接来挑菌尝试下.
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11楼2011-04-20 08:58:35
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sunjump

至尊木虫 (知名作家)
★
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路过，观摩大家看法
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12楼2011-04-20 09:07:35
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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西瓜(金币+2): 鼓励。一直很活跃啊~ 2011-04-20 15:30:19
引用回帖:
Originally posted by djrhewc at 2011-04-20 08:29:39:
你好，我也遇到这个问题，做蓝白斑筛选时，板上白斑很多，蓝斑极少，但挑取白斑做菌落PCR，基本上只有几个有目的片段，其余全是空载。然后我做了一个对照，直接将空载体转入感受态细胞涂板，结果，板上还是还是 ...

遇到这种情况第一直觉就是显色剂的问题，当然如果能排除显色剂问题，下一个就该怀疑你的载体是不是被污染了，这时一般会转空质粒把蓝斑挑出来摇菌提质粒，不过最保险的办法是重新购买载体
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
13楼2011-04-20 12:26:01
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beibei9535

荣誉版主 (职业作家)

晕晕小版主~ 姑娘你好！

优秀版主优秀版主
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+6, EPI+1): 2011-04-20 13:49:23
首先解决你问题。
其次，想给点建议，希望能明白蓝白斑筛选的原理和注意事项。

1、为什么我在蓝白斑筛选的时候，板子上全是白斑，没有篮班，但是菌液pcr检测的时候，跳了120多个菌，才有2个p出目的条带！
额，第一看自己的载体有蓝白斑筛选标记嘛？第二，看X-GAL和IPTG是否失效。X-GAL是密闭保存的，一般用灰色或者锡纸包装起来，会见光分解故失效。第三，没有蓝斑，可以放在4度冰箱下一段时间，会有显色。但是不以为这有白斑就是有目的条带，还是得做菌液PCR或者菌落PCR。
2、为什么我的板子上白斑少，并且都在靠近培养皿的边上，连成一片，没有分开！
有时候白斑多不见得是成功了，也有可能是假阳性。靠边连成片的最好不要选。因为都不是均一菌体了。考虑如下原因第一，没有涂云。第二，培养时间过了？
原则上，尽量从中间选择单个菌落。这样菌体一致。边上由于涂板时候毕竟会不匀，故尽量弃之。

祝福你早日解决问题！！
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最好的年龄是，那一天，终于知道并且坚信自己有多好，不是虚张，不是夸浮，不是众人捧，是内心明明澈澈知道：是的，我就是这么好。
14楼2011-04-20 13:09:21
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djrhewc

银虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
Originally posted by beibei9535 at 2011-04-20 13:09:21:
首先解决你问题。
其次，想给点建议，希望能明白蓝白斑筛选的原理和注意事项。

1、为什么我在蓝白斑筛选的时候，板子上全是白斑，没有篮班，但是菌液pcr检测的时候，跳了120多个菌，才有2个p出目的条带！
额 ...

分析的不错,考虑下
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15楼2011-04-20 14:28:03
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fhh819

银虫 (小有名气)
谢谢各位给出宝贵的意见！昨天，我做了个空质粒转化感受态细菌，平皿上全是密密麻麻的小白斑，分析，有可能是感受态细胞失火啦！今天定了新的载体和感受态细胞，等下个星期货到啦再转下看！
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俱怀逸兴壮思飞，欲上青天揽明月！
16楼2011-04-21 20:34:48
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