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【专题】细胞活力检测------MTT比色法 已有2人参与
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Q：细胞活力检测中，MTT比色法的原理？ A：活细胞中的脱氢酶能将MTT还原成不溶于水的蓝紫色产物（甲臜，Formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中的蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的Formazan量成正比，最后用酶标仪测定OD值。 Q：MTT比色法细胞活力检测实验中有哪些注意事项？ A：（1）选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的内贴壁细胞长满时约有lo6个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT比色法细胞活力检测实验前，掌握每一种细胞的贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定实验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证形成酌量的MTT结晶，与细胞数量呈线性关系。 （2）避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高浓度的血清物质会影响实验孔的光吸收值。由于实验本底增加，会使实验敏感。因此，一般选择浓度小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。 3）设空白对照。与实验孔平行设不加细胞只加培养液的空白孔。其它实验步骤保持一致。最后比色时，以空白孔调零。 Q：MTT比色法细胞活力检测染色后，96孔板中的上清弃去后是否要用PBS洗一下再加二甲亚砜？ A：不必洗，MTT与Fomazan的颜色不同，吸光谱也不同，实际上测的是OD570的吸收光，实际MTT的吸光度在此波长很小。Fomazan对细胞是有害的，部分细胞死掉后，Formazan结晶在其周围，如果清洗就丢失了。 Q：MTT比色法细胞活力检测中对照设置很重要吗？ A： MTT比色法细胞活力检测中最重要的就是背景对照，就是不加细胞的对照。这包括两方面内容，一是指与实验孔相同，对照孔中也加入相同体积的培养基，各做3-4个复孔，取平均值，主要目的是为了减少培养基中含有的酚红对比色的影响；二是要在对照孔内加入与实验孔相同成分和浓度的药物（特别是药物pH值为酸性或碱性时），同样也是为了减少比色时的误差。 Q：如何解决酶标仪测出的数据总是不稳定、重复性差的问题？A：加样CV控制在5%以内； 防止细胞丢失； 充分震荡，溶解甲臢； OD值尽量控制在0.3-0.6之间； 做空白对照。 Q：如何让二甲亚砜溶解充分？ A：如果细胞是贴壁生长的，吸弃上清液后，每孔加入150 μl 二甲亚砜，振荡10 min；如果是悬浮生长的细胞，需离心（1000 rpm，5 min），然后弃去孔内培养液后再加二甲亚砜。 Q：MTT法细胞活力检测细胞活力时，如何确定加药物的时间？A：一般文献报道的方法，是贴壁细胞在细胞贴壁后加药物（一般为上板后24h），而悬浮细胞是上板同时加。 但是，在操作中具体要根据实验本身要检测的指标来确定时间。如果是做有关细胞增殖的药物，加药的时机影响不大，主要是药物的作用时间起决定性因素；如果要检测的是其他一些指标（比如药物对细胞黏附功能的影响），就要在细胞贴壁以前加药了 Q：MTT法细胞活力检测贴壁细胞活力时，如何确定细胞接种到96孔板的时间？ A：贴壁细胞一般在实验前1-2日接入96孔板。太晚，细胞在传代后有一个16小时左右的停滞期，此时代谢变慢，增殖缓慢，此时的MTT数值太低；太早，实验期间，细胞生长过头，此时有死亡和凋亡的细胞，实验时本底又过高，应该寻求的效果是实验时落在细胞对数早中期最好。 |
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