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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于分子克隆的技术问题，很纠结！
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ybQuan

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】关于分子克隆的技术问题，很纠结！

本人在做昆虫线粒体基因COII的克隆，有一个问题总是偶尔出现。
鉴定为阳性的克隆菌液测序后，有的是正常的，700多片段，正反测序结果都能找到上下游引物，结果没问题。
但是有的菌液只能在正向或者反向测序中分别找到一条引物，另一条引物找不到。
拼接后壁正常的片段多出几百碱基，插在正常片段的中间。剪切下来BLAST后发现这段是质粒的片段！
为什么会这样的(⊙o⊙)？
是我操作中污染了还是测序中出现问题？
哪位大虾能解释一下？
灰常 3ks and u 能领到BB
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1楼 2011-03-24 09:34:37
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ybQuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by zhangxn2010 at 2011-03-24 10:59:05:
怀疑是酶切的时候把载体也切了，同目的基因连接到一起了。
再做一遍吧

谢谢你了
不过我没有做酶切，直接送菌液测序。如果他们测序要做没切的话可能是测序的问题，就不是我克隆的问题了吧
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5楼2011-03-24 13:03:50
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ybQuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 2140061 at 2011-03-24 10:04:53:
污染了吧

能具体点不？
这点我知道
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3楼2011-03-24 10:38:39
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
★
ybQuan(金币+1):谢谢参与
ybQuan(金币+1): 谢谢 2011-03-24 13:02:52
怀疑是酶切的时候把载体也切了，同目的基因连接到一起了。
再做一遍吧
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-03-24 10:59:05
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jiangzhiang

铁杆木虫 (正式写手)
★
ybQuan(金币+1):谢谢参与
是不是反向插入载体了？要不你试试把上游引物当下游引物，下游引物当上游引物再找找，不知道行不行
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2011-03-24 13:26:26
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