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[交流]
【求助/交流】抗癌药物-凋亡-western
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大家好，我是western得新手，最近在做一个化合物的抗癌作用，关于促进凋亡的，在做MAPK 通路时，发现了些问题，请大家帮忙解决一下吧，谢谢了 （1）western做出来的结果随着浓度增加，不仅磷酸化的JNK，p38增加，而且总的JNK，p38也升高，这样正常吗？ （2）结果还显示随着浓度增加，磷酸化的ERK1/2降低，总的ERK1/2增加，这样正常吗？ 谢谢大家了。。。。。。。 |
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dhd997(金币+8): good 2011-03-26 08:46:30
lv840716(金币+5): 2011-03-26 13:30:28
dhd997(金币+8): good 2011-03-26 08:46:30
lv840716(金币+5): 2011-03-26 13:30:28
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有变化是好事啊，就怕没有变化呢。首先你要确定这个变化的稳定性，你的需要重复实验三次左右，每次run gel的时候 loading control和target protein都要在一张膜上进行western，要保证你的loading control bands很平，这样才能证明结果的可信性。 确定结果可信后，这个结果就是很不错的了。总蛋白浓度的变化和磷酸化水平的变化不一致是很正常的现象。总蛋白浓度的升高可以有两种方式：一种是转录水平的提高，这个不能用western来证明，需要做RTPCR来检测mRNA水平。另一种是转录后调控造成的总蛋白浓度变化，比如negative regulateor或者positive regulateor蛋白的浓度或活性的变化造成的，或者是蛋白本身进行转录后修饰后在细胞内half-life period的变化。 而磷酸化其实就是蛋白转录后修饰的一种，一般的是在你加药物后改变了细胞内环境，触发了某条信号通路，激活了一些上游的激酶，这些激酶进而磷酸化了下游的蛋白。这个过程跟总蛋白浓度的变化没有必然的联系的。磷酸化的作用也是多元化的，有些是改变蛋白的生物活性，有些是改变蛋白的稳定性和细胞内定位。 要解释你的现象你需要对相关的信号通路有足够的了解，而且光一个western是不够的，你可能需要对你怀疑的相关信号蛋白都做western，或者做一些RTPCR实验。 |
8楼2011-03-26 08:33:58
9楼2011-03-26 08:57:47
10楼2011-03-26 13:35:14
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lv840716(金币+5): 谢谢 2011-03-27 09:10:10
dhd997(金币+6): good 2011-03-27 16:25:22
lv840716(金币+5): 谢谢 2011-03-27 09:10:10
dhd997(金币+6): good 2011-03-27 16:25:22
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在讨论药物对肿瘤细胞的signal pathway影响的时候哪有什么一般而言啊。。。肿瘤细胞本身就是disorder的，而药品更是种类繁多，除非你看到别人跟你用一样的cell line。一样的treatment condition。否则就不要轻易否定自己的实验结果。总蛋白水平和转录后修饰反应是信号转导研究中很普遍的两个研究对象了，MAPK我没自己动手检测过不敢说，我自己做的P53pathway就是很好的例子，受外源胁迫信号刺激后，细胞的反应往往都是总蛋白浓度和转录后修饰同时变化的。。这个是很常见的。很多文章发现某药物对蛋白总浓度和磷酸化同时有影响或是某一个有影响另一个无影响的都只是只给个result，都不做过多的discussion了，因为这种波动性太常见了。。真要解释起来却又很难，大多数都是一些猜测和假说了。 |
13楼2011-03-26 15:31:51
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zyxme3楼
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2011-03-26 13:58
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xiaovae12楼
2011-03-26 14:42
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